李世闯,蔡 帅,郭秋爽,张铭楷,李 华,刘宇鹏

(河南大学生命科学学院微生物工程研究所,河南开封 475004)

雄烯二酮是一类内源性类固醇激素,可由人体性腺及肾上腺分泌,是体内雄性激素合成途径中睾酮的直接前体,也是雌性激素合成途径中雌激素的前体。它在合理控制雄激素和雌激素的平衡中起到至关重要的作用[1-2]。雄烯二酮可调节男性体内的睾酮含量,使得男性雄激素的含量增加,从而使得性能力增加。雄烯二酮能够将卵巢环境中的雄激素水平提高到正常范围,从而促进卵巢内卵泡的生长并且修复卵巢组织,增加妊娠的机率。另外,雄烯二酮还是甾体药物合成的重要中间体,通过雄烯二酮几乎可以合成所有的甾体药物[3-4]。

目前我国生产雄烯二酮主要是从野生中药材“穿地龙”等植物中提取薯蓣皂素经化学合成而成,不仅工艺复杂、消耗成本高,而且污染环境。自从Sih等发现利用微生物可以切除甾醇的饱和侧链后,以自然界的动植物甾醇为原料生产甾体类药物的研究进展迅速。姜绍通等[5]进行了两相系统转化植物甾醇为雄烯二酮的研究,结果表明,当有机相为大豆油,有机相所占比例为22%,发酵7 d,投料量为4 g/L时,植物甾醇的转化率最高,达到85.7%。但是底物浓度太低,发酵时间长、易染菌,同时含有有机相,分离提取比较困难。王艳婷[6]利用双水相体系进行了降解植物甾醇侧链和制备雄烯二酮的研究,在吐温40添加量1%(V/V)、转速240 r/min的条件下,植物甾醇投料浓度提高到10 g/L,发酵96 h后雄烯二酮的浓度达到1.1 g/L。传统发酵方法生产雄烯二酮主要的限制因素是植物甾醇不溶于水,导致转化率低,同时提取也比较麻烦。游离细胞法比传统的发酵法生产有不怕染菌、反应时间短、反应条件温和、分离提取简单等优点[7-8]。王志龙等利用游离细胞法在浊点体系中降解植物甾醇生成雄二烯二酮[9],在转化4 d时雄二烯二酮浓度达到12 g/L。申雁冰等发现β-环糊精可以提高植物甾醇的水溶性[10]。如果把游离细胞法和环糊精结合起来,可能会得到比较好的结果。

因此,本论文使用PB设计法[11]、最陡爬坡路径法和响应面中的Box-Behnken设计相结合对雄烯二酮的转化条件进行优化,提高转化率,以期为工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄甾-4-烯-3,17-二酮标品(纯度99.99%) Sigma公司;植物甾醇(纯度95%) 西安岳达生物科技股份有限公司;羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD) 山东新大精细化工有限公司;其它试剂 均为市售分析纯;菌种:分枝杆菌Mycobacteriumsp. NRRL B-3683 由河南大学生物工程研究所保存;种子培养基(g/L):葡萄糖20,柠檬酸2,柠檬酸铁铵0.05,K2HPO4·3H2O 0.5,MgSO40.5,玉米浆10,植物甾醇 0.1～1,pH8.0。初始游离细胞转化培养体系组成:0.02 mmol/L pH为8.0磷酸缓冲液100 mL,植物甾醇1 g,羟丙基-β-环糊精4 g,菌体5 g。

Scout SE电子天平 奥豪斯仪器有限公司;STARTER2100 pH计 奥豪斯仪器(上海)有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;QHZ-98A全温振荡培养箱 太仓市华美生化仪器厂;BioFLO4000BIOREACTOR 7 L发酵罐 NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC公司;H1850R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;气相色谱GC-2014C 日本岛津制作所。

1.2 实验方法

1.2.1 收集菌体 一级种子培养,配制1瓶50 mL种子培养基,121 ℃灭菌30 min。将甘油管接种到培养基里,然后放入摇床中,30 ℃、200 r/min培养3 d。二级种子培养,配制3瓶90 mL种子培养基,121 ℃灭菌30 min,然后接种一级种子,接种量10%(V/V),然后放入摇床中,30 ℃、200 r/min培养3 d。7 L发酵罐:配制2.7 L种子培养基,121 ℃灭菌30 min,冷却后接种二级种子,接种量10%(V/V)。300 r/min,30 ℃培养1.5 d。然后把种子液用离心机离心,8000 r/min,4 ℃,离心3 min,离心完后倒掉上清液,菌体收集完后,再加入0.02 mmol/L pH为8.0的30 mL磷酸缓冲液润洗3次,离心收集菌体细胞(菌体浓度为21.6 g/L,湿重),然后放置备用。

1.2.2 游离细胞法生产雄烯二酮工艺优化 在500 mL摇瓶里加入1 g甾醇、4 g羟丙基-β-环糊精和5 g菌体,然后加入0.02 mmol/L pH为8.0的100 mL磷酸缓冲液,在摇床中以180 r/min、30 ℃振荡培养,转化4 d后取样测定,测得雄烯二酮转化率为47.51%。为了提高雄烯二酮的转化率,设计如下实验。

1.2.2.1 Plackett-Burman试验 将初始反应体系的8个组分作为影响因素进行全面考察,选择11因子及实验次数N=12的实验设计,以X3、X6、X9作为空项以估计实验误差,以X1、X2、X4、X5、X7、X8、X10、X11分别代表羟丙基-β-环糊精浓度、反应时间、磷酸缓冲液浓度、磷酸缓冲液pH、摇床转速、摇床温度、植物甾醇浓度、菌体量,每个因素取高低2个水平(表1)。

表1 Plackett-Burman设计各因素与水平Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels

1.2.2.2 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman实验设计的结果,做最陡爬坡实验。以植物甾醇、羟丙基-β-环糊精、菌体量为考察因素,以转化率高低为指标,确定合适的范围。

1.2.2.3 Box-Behnken中心组合试验 用爬坡设计得出的实验结果为依据进行Box-Behnken设计(表2),用SAS 8.0软件对实验进行回归分析并求得最优值,得出响应面分析结果,确定最佳转化体系,最后依据回归方程绘制响应面分析图。

表2 Box-Beehnken设计因子及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

表3 Plackett-Burman实验设计Table 3 Plackett-Burman experimental design

1.2.3 雄烯二酮转化率测定

1.2.3.1 样品处理 取10 mL乙酸乙酯加入1 mL转化液萃取,在摇床中振荡30 min,转速为200 r/min。然后再取9 mL乙酸乙酯加入1 mL萃取后的转化液(稀释100倍)。

1.2.3.2 检测方法 用薄板层析法对雄烯二酮进行定性测量。点样,剪裁合适大小的硅胶板,在硅胶板底边1.5～2 cm处画线,用毛细管吸取试剂在直线上每隔1 cm左右点样。层析:将展层剂(乙酸乙酯∶正己烷=7∶3)加入层析缸中均匀混合,待硅胶板的样点凉干后,放置层析缸内,静止大约30 min左右,直至展开剂上升到薄板上沿0.5～1.0 cm左右,停止层析。显色:取出硅胶板,用吹风机吹干,用50%浓硫酸作为显色剂,放置于105 ℃的烘箱,加热5～10 min。取出观察,硅胶板上各物质的显色情况和斑点大小。植物甾醇显紫色、雄烯二酮显浅蓝色、显浅黄色的是转化液样品,成分比较复杂。

采用气相色谱法进行定量测定[12]。气相色谱使用装备有DB-1柱(30 m×0.53 mm×0.25 μm)的Shimadzu GC-2014C,以高纯度氮气作为流动相,速率为1.0 mL/min。初始柱温为220 ℃,保持3 min,然后以20 ℃/min升温至280 ℃,保持14 min。进样口和检测器FID分别为280和310 ℃。进样量为2 μL。

式中,C1:转化结束后雄烯二酮的浓度;100:稀释倍数;C2:初始植物甾醇的浓度;0.95:植物甾醇的纯度;0.70:雄烯二酮与植物甾醇的相对分子质量之比(MAD=286.6,M甾醇=406.8)。

1.3 数据处理

每个实验做3次,取其平均值作为实际转化率。运用SAS 8.0软件进行方差分析,采用Origin 8.5软件做图。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman实验结果

Plackett-Burman实验设计法是一种近饱和的2水平实验设计方法。它可以用很少的实验次数估出因素的主效应,从大量的考察因素中选出最重要的几个以供进一步研究[13]。Plackett-Burman实验设计见表3,分析结果见表4。从表4的P值大小可以看出,对雄烯二酮转化率具有显著影响的因子分别是植物甾醇浓度、菌体量以及羟丙基-β-环糊精浓度,从表4中的t值可以看出,植物甾醇浓度、菌体量对雄烯二酮转化率为正效应,羟丙基-β-环糊精浓度为负效应。确定这3个因素作为下一步实验的关键因素。

表4 Plackett-Burman实验分析结果Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment

2.2 最陡爬坡实验

最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向,根据各因素效应值的大小确定变化步长,能快速、经济地逼近最佳值区域[14]。从表5可以看出,随着植物甾醇浓度、菌体量依次增大,羟丙基-β-环糊精浓度依次减小,雄烯二酮的转化率先增大后减小。当植物甾醇浓度为20 g/L,羟丙基-β-环糊精浓度为80 g/L,菌体量为100 g/L,雄烯二酮转化率(65.71%)最大。所以后续实验的中心点按照编号3情况下每个因素的量进行。

表5 最陡爬坡实验设计结果Table 5 Experimental design of steepestascent and corresponding results

2.3 响应面设计结果与分析

3个重要因子的最适浓度范围确定后,以植物甾醇浓度20 g/L、羟丙基-β-环糊精浓度80 g/L、菌体量100 g/L为中心点实施响应面分析,设计和结果分析见表6和表7。用SAS 8.0软件对数据进行分析。

表6 Box-Benhnken试验设计Table 6 Design of Box-Benhnken experiment

表7 Box-Behnken设计回归分析Table 7 Regression analysis of Box-Behnken design

图1～图3为根据拟合方程做出的响应面分析图。从响应面图可以看出,随着植物甾醇浓度、羟丙基-β-环糊精浓度、菌体量的增加,雄烯二酮的转化率是增加的,但不是持续增大,当这三个因子的浓度到一定值时,雄烯二酮的转化率开始下降。可利用SAS软件进行脊岭分析找到这3个因子的最佳值,来得到最大转化率。由SAS 8.0软件求出,当植物甾醇

图1 植物甾醇浓度和羟丙基-β-环糊精浓度对转化率影响的响应面图Fig.1 Response surface graph of the effectphytosterol concentration and hydroxypropyl-β-cyclodextrin concentration on conversion rate

浓度为19.41 g/L,羟丙基-β-环糊精浓度为80.14 g/L,菌体量为110.55 g/L,得到雄烯二酮预测最大转化率为67.69%。

图2 植物甾醇浓度和菌体量对转化率影响的响应面图Fig.2 Response surface graph of the effect of phytosterolconcentration and bacterial cell amount on conversion rate

图3 羟丙基-β-环糊精和菌体量对转化率影响的响应面图Fig.3 Response surface graph of the effect ofhydroxypropyl-β-cyclodextrin concentrationand bacterial cell amount on conversion rate

2.4 模型验证

为证实预测结果,在植物甾醇浓度为19.41 g/L,羟丙基-β-环糊精浓度为80.14 g/L,菌体浓度为110.55 g/L条件下重复3次摇瓶实验,结果分别为66.54%、67.35%、67.86%,平均值为67.25%,与预测值接近,二者的良好拟合性证实了模型的有效性。优化后的转化体系为磷酸缓冲液浓度0.02 mmol/L,磷酸缓冲液pH6.5,摇床转速180 r/min,摇床温度28 ℃。

图4为最优条件下的雄烯二酮转化率随时间变化,从图4中可以看出,第4 d时雄烯二酮转化率最高,达到67.25%,此时雄烯二酮产量为8.68 g/L,生产强度达2.17 g/(L·d)。

图4 雄烯二酮转化曲线图Fig.4 The conversion curve of androstenedione

3 结论

本文利用游离细胞法生产雄烯二酮进行了研究,先通过Plackett-Burman设计快速有效地从8个影响游离细胞转化植物甾醇生产雄烯二酮的因素中筛选出3个显著性影响因素:植物甾醇浓度、羟丙基-β-环糊精浓度、菌体浓度;然后利用最陡爬坡法逼近最大响应值区域并用Box-Beehnken设计对转化体系进行优化,建立了各因素与雄烯二酮转化率之间的数学模型,取得了良好的试验结果。结果表明:当植物甾醇19.41 g/L,羟丙基-β-环糊精80.14 g/L,菌体量110.55 g/L时,雄烯二酮转化率达到67.25%,比优化前提高了41.55%。相比于化学法生产雄烯二酮,本论文采用的方法生态环保,同时原料来源广泛,转化率高。游离细胞法生产雄烯二酮的转化率和生产强度均高于发酵法,具有较大的优势。今后,将进一步优化产品的提取纯化工艺,提高雄烯二酮的提取收率,为工业化应用提供基础数据。