李丙子,魏红艳,雷 芸,陈 骋,张玉斌,*

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070；2.兰州文理学院化工学院,甘肃兰州 730000)

牦牛(Bosgrunniens)是生长在青藏高原地区的动物之一,是世界上唯一能够在海拔3000 m以上生存的牛种,牦牛长期生活在高原地区的缺氧、低温以及饲料缺乏的环境下,具有极高的适应力和抗逆性,牦牛生存环境处于高寒低氧的生态条件,血红蛋白与肌红蛋白含量较高,肉色比黄牛肉及猪肉更深红[1]。在牦牛肉加工、储运及销售的过程中,随着鲜肉货架期延长和后续的加工处理,肉色表现出稳定性变差、商业价格变低等现象。对于肉类加工业以及零售业来说,生鲜肉在贮藏和零售过程中,其外观颜色是决定肉商品价值的最重要因素,决定了绝大多数消费者的购买意向[2]。因此,如何对宰后冷藏期间生鲜肉的色泽劣变进行有效的控制,延长货架期并提高肉制品质量,是目前急需解决的问题。

乳酸及其盐类最初是以其防腐抑菌作用被应用于肉制品加工业中的[3-4]。但最近十年已有大量研究者报道添加乳酸盐对肉色稳定性的影响,由此一些学者提出了底物和中间代谢物在肉中高铁肌红蛋白(MMb,Metmyoglobin)还原作用途径的乳酸+乳酸脱氢酶+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸体系假说[5-7],同时部分研究者证实了线粒体和胞浆之间存在着乳酸盐的穿梭作用[8]。乳酸盐的循环和穿梭是构成多细胞生物氧化还原、能量和物质代谢、酸碱平衡、合成与分解的基本条件[9]。目前有关乳酸盐增强调控牛肉色泽稳定性的基本机理,研究主要聚焦在以下两个方面:肌红蛋白(Myogolobin,Mb)和乳酸盐的直接互动作用以及酶促反应和细胞系统的间接作用[10]。有相关研究已经证明乳酸盐可以调节Mb的功能[11]。但是,肉中MMb的还原是一个复杂的反应体系。因此很有必要构造一个体外综合的肉色稳定性分析方法,以体系研究的思路代替对单一物质的研究[12]。Ramanathan等[13]发现在pH5.6和7.4(4 ℃)体外孵化条件下,乳酸盐和氧合肌红蛋白(OMb)的结合改善了氧化还原稳定性。Kim等[14]提出了一种更间接的机制,其中乳酸盐通过乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)介导的NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide),产生从而提高了颜色的稳定性。尽管以前的研究已经评估了乳酸盐和肉色稳定性之间的关系,但乳酸盐对Mb的更直接的作用机制并没有更多的研究。

迄今为止,几乎没有研究能够确认乳酸盐和Mb的共价加合作用,到底是通过与血红素辅基还是非血红素配体结合途径来调节Mb的功能进而影响肉色稳定性的机制。因此,本实验从牦牛背最长肌中提取分离Mb体,在体外重建Mb-乳酸盐体外孵化反应模型,从Mb血红素辅基的角度出发,采用紫外-可见光谱、荧光光谱和圆二色谱研究乳酸盐与Mb的相互作用机制,为生物体内乳酸盐对肌红蛋白的调控提供可靠实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验牦牛肉样品 采样自甘肃天玛生态食品科技股份有限公司,选取年龄1～3岁生长发育良好、健康无病的甘南牦牛,屠宰后取牦牛背最长肌,剔除脂肪、筋膜,避光、真空包装后置于恒温箱运送回实验室,在24 h之内进行肌红蛋白的分离纯化;丙稀酰胺溶液、Tris-HCI、SDS、APS、TEMED 分析纯;Sephadex G-100 prep grade、DEAE-52 GE;马心肌肌红蛋白标品 Sigma;预染Marker 北京康润科技有限公司;MES 天津光复精细化工研究所。

PPS-2型蛋白纯化仪 上海金达生化仪器有限公司;J-810型圆二色光谱仪 日本分光株式会社JASCO公司;LS-55荧光分光光度计 美国PE公司;SP-756P紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;25 D电泳槽 北京六一仪器厂;TGL-24M台式高速冷冻离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司;AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司;XHF-D高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肌红蛋白的分离纯化与鉴定 参考Thiansilakul等[15]的方法稍加改进。取切碎后的肉样100 g,在4 ℃预冷的300 mL提取液(含1 mmol/L EDTA、10 mmol/L pH8.0 Tris-HCl、25 g/L Triton X-100)中混合,在低温高速冷冻离心机中13000 r/min均质30 s,取出匀浆液,将其在9500 g、4 ℃下离心10 min,取上清液,用滤纸过滤后得到Mb粗提液。采用硫酸铵溶液对粗提液进行分级沉淀,饱和度梯度由65%至95%,然后4 ℃条件下3000×g离心10 min后弃去上清液,将沉淀物在5 mmol/L pH8.5的Tris-HCl缓冲液中溶解。然后用提前预冷至4 ℃的相同缓冲液透析10 h,透析液每隔1 h换一次,透析结束后在4 ℃下5000×g离心10 min,得到Mb初级纯化液。接下来采用Sephadex G-100凝胶层析分离柱进行精细纯化,以5 mmol/L pH8.5的Tris-HCl缓冲液平衡层析分离柱,然后取适量初级纯化液上样,用上述缓冲液以0.5 mL/min的流速进行洗脱,在540和280 nm(280 nm处为蛋白质的特征吸收峰)处检测吸光值。由于肌红蛋白在540 nm处具有特征吸收峰,因此,收集在该波长下吸光值较高的蛋白溶液,分离得到的Mb参考Laemmli等[16]的方法对其进行光谱特性和SDS-PAGE鉴定。

1.2.2 肌红蛋白光谱特性检测 参考马兰等[17]的方法,将经过1.2.1处理后的纯化液进行光谱测定已知肌红蛋白中铁离子在576 nm处有特征吸收峰,并且在该波长下的毫摩尔消光系数为12.8 L/(mmol·cm),因此根据上清液在576 nm下的吸光值,计算样品中肌红蛋白(Mb)的含量,即:

式中:CMb:肌红蛋白含量,μmol/g;A576:576 nm处吸光值;V:溶液体积,mL;m:样品重量,g。

1.2.3 SDS-PAGE鉴定 参考Laemmli等[16]的方法。使用SDS-PAGE分析样品对照组与处理组肌红蛋白。按照表1分别配制浓度为15%的分离胶和4%浓缩胶。蛋白溶液与样品缓冲液按体积比1∶1混合均匀后沸水加热5 min。冷却后进行电泳,上样量40 μL,浓缩胶电压70 V,分离胶电压120 V。电泳结束后剥离胶面,染色液染色40 min,脱色液脱色至条带清晰可见。

表1 SDS-PAGE电泳凝胶配方(mL)Table 1 The formula of SDS-PAGE gel(mL)

1.2.4 体外反应模型系统的构建 pH5.6的磷酸盐缓冲溶液体系(模拟肉成熟过程中pH),Mb溶液浓度1×10-5mol/L,选取乳酸钙,浓度为1×10-4mol/L,加入提取的Mb溶液中(参考张玉斌等[18]实验结果0.3%为最佳添加量,加入的乳酸钙为肌红蛋白溶液含量的0.3%),对照为Mb磷酸盐缓冲溶液,4 ℃条件下冷藏72 h,测定0、12、36、72 h,4个时间点肌红蛋白的结构变化情况。

1.2.5 紫外-可见吸收光谱测定 分别取不同时间点处理样品移取至1.0 cm石英比色皿,以Mb磷酸盐缓冲溶液为空白样品进行对比,扫描300～550 nm波长范围内的紫外吸收光谱。

1.2.6 荧光光谱测定方法 使用LS-55荧光分光光度计进行测定,测试条件:1.0 cm石英比色皿,激发波长430 nm,荧光发射与激发狭缝宽度均为10 nm,扫描速度500 nm/min,扫描500～700 nm波长范围内的荧光光谱。

1.2.7 圆二色光谱测定 采用圆二色光谱仪,长波范围163～900 nm氙灯作为光源;测定条件:扫描范围190～300 nm,狭缝宽度1 nm,扫描速度50 nm/min,响应时间1 s。

1.3 数据处理

试验中所有测定均做3次重复,试验结果表示为平均值±标准差。采用SPSS 19.0统计分析软件(美国IBM公司)进行试验数据处理,平均数之间的显著性差异(P<0.05)通过LSD法进行比较分析,用Origin 8.0软件(美国Origin Lab公司)进行图制作。

2 结果与分析

2.1 牦牛背最长肌肌红蛋白Sephadex G-100凝胶层析分离

图1可知,Sephadex G-100凝胶柱共分离出3种组分,分为组分1、组分2、组分3,其中三种组分均在280 nm的吸光度系下出现吸收峰,但组分1和组分2未在540 nm处呈现出较为明显的光谱吸收峰,其中组分3的吸收峰分离度比其他三种组分组分明显,并且在肌红蛋白特征吸收峰(540 nm)处,呈现出较为明显的光谱吸收峰,因此初步判定组分3为分离后的肌红蛋白提取液。

图1 牦牛背最长肌肌红蛋白Sephadex G-100凝胶层析洗脱曲线Fig.1 Elution profile of myoglobin from yak LDon Sephadex G-100 column

2.2 牦牛背最长肌Mb分离纯化

由图2可知对比肌红蛋白粗提液、初级纯化液和精细纯化液组分3的SDS-PAGE电泳发现,肌红蛋白粗提取液中蛋白质种类繁多,并且分子量主要分布于17～45 kDa之间,在17 kDa处有明显的肌红蛋白条带,肌红蛋白的纯度较低,仅为18.52%。经过硫酸铵沉淀初步纯化后,杂蛋白种类明显减少,肌红蛋白特征条带处有所加深,肌红蛋白的纯度增加到35.09%,但纯度并未达到体外孵化要求。经过高分辨率的Sephadex G-100凝胶层析柱进行精细纯化后,得到的组分3中蛋白质的电泳条带只出现在17 kDa处,说明组分3中蛋白质组分单一,肌红蛋白纯度为94.55%。通过光谱吸收曲线进一步对上述结果进行的验证,在450～650 nm波长范围内,肌红蛋白的特征吸收峰分别出现在了540和580 nm。说明通过Sephadex G-100凝胶层析法能够得到高纯度的肌红蛋白。

图2 肌红蛋白的光谱特性和SDS-PAGE鉴定Fig.2 Spectral characteristics and SDS-PAGE identification of myoglobin注:1:肌红蛋白粗提取液;2:肌红蛋白初级纯化液;3:肌红蛋白精细纯化液组分3。

2.3 牦牛背最长肌Mb与乳酸钙结合的紫外-可见吸收光谱分析

由图3可知,对照组四个不同的时间点在409 nm的吸光度分别为1.31、1.40、1.51、1.38,随着时间的增长在36 h时达到最大值,处理组在409 nm处不同时间的吸光度为1.96、1.98、1.82、1.79,相比于对照组分别增加了0.65、0.58、0.31、0.41。该现象说明乳酸钙对Mb分子中的血红素辅基影响较小。只是与肌红蛋白表面的氨基酸残基发生了作用,因为极性氨基酸残基几乎全部分布在分子表面,可与水结合,使肌红蛋白具有可溶性[19]。

图3 不同时间点下乳酸钙与肌红蛋白的紫外-可见光谱特性Fig.3 UV-Vis spectra character of myoglobin at different time

2.4 牦牛背最长肌Mb与乳酸钙结合的荧光光谱分析

由图4可以看出,对照组肌红蛋白的血红素铁卟啉环在597 nm处有一个荧光发射峰,当加入一定量的乳酸钙后,597 nm处发射峰强度减弱,随着贮藏天数的增加,发射峰强度先增加至12 h最大值,后继续减弱。但与紫外检测的结果一致,用荧光光谱检测肌红蛋白的铁卟啉环的发射峰位置没有发生位移,但它的荧光强度随着贮藏时间的延长而减弱,添加乳酸钙的处理组在0、12、36和72 h比对照组分别下降了4.64%、13.50%、18.30%和18.32%,发生荧光猝灭。但并没有发生红移或蓝移现象(注:蓝移或者强度发生变化说明二者相互作用,导致荧光性质改变。如果是因为外来物质的加入使得荧光性质改变,使得荧光基团的疏水性增加,极性变小。红移则相反),说明乳酸钙与肌红蛋白的血红素铁卟啉环并未直接发生反应。

图4 不同时间点下乳酸钙与肌红蛋白的荧光光谱特性Fig.4 Fluorescence spectra character of myoglobin at different time

2.5 牦牛背最长肌Mb与乳酸钙结合的圆二色谱分析

从图5可以看出,肌红蛋白的光谱图是带有螺旋结构的谱图,即对照组和乳酸钙处理组在192、208和222 nm远紫外区附近,圆二色光谱都明显可见一个典型的正峰和二个负峰的特征肩峰谱带,它们均代表α-螺旋结构的特征峰,在反应体系中加入一定浓度的乳酸钙对肌红蛋白二级结构的影响甚微,远紫外区3个特征峰的形状和肩峰的位置未发生明显改变,190～240 nm处的图谱在乳酸钙处理组中和对照组一样曲线平滑,说明乳酸钙并未与Mb血红素中心Fe原子发生了配位,这与上述紫外-可见光谱、荧光光谱图结果相吻合。

使用光谱数据用目前较为常用的计算网站K2D2提供的方法进行比较。本研究中选取波长190～240 nm段图谱拟合51个数据点,经计算和预测,其主要的二级结构为α-helix,对照组中α-helix 的含量为87.70%,β-strand的量为0.48%,在乳酸钙处理组中α-helix 的含量为87.76%,β-strand的含量为0.47%,对照组与乳酸钙处理组完全无差异。Mb的CD光谱在K2D2网页中的拟合结果表明,进一步根据Beer-Lambert定律进行计算验证,实际测定结果软件拟合计算结果相差不大。

图5 不同时间点下乳酸钙与肌红蛋白的圆二色谱特性Fig.5 CD spectra character of myoglobin at different time注:pH5.6,Mb溶液浓度1×10-5 mol/L。

3 讨论

肌红蛋白是一种含有血红素的储氧蛋白,其在 Soret带和Q带的吸收峰是由卟啉环共轭体系π-π*跃迁引起的[20]。Soret带在409 nm有一个强吸收峰,它是血红素卟啉环上的特征谱带,因此紫外一可见吸收光谱在409 nm处的吸收峰能够反映血红素辅基与肤链的结合情况。马静等[21]利用紫外-可见吸收光谱法对肌红蛋白与Cu2+相互作用进行了研究,发现随着Cu2+的加入使Mb的的紫外吸收增强并且峰位蓝移,说明Mb与Cu2+发生了较强的相互作用。本研究发现随着乳酸钙的加入,每个时间点处理组的紫外吸收强度增加,但并未发生蓝移说明并未发生较强的相互作用。张越等[22]用分子荧光光谱法和紫外可见分光光度法研究了肌红蛋白与亚硝酸钠的相互作用,发现随着溶液中NaNO2浓度的增加,肌红蛋白在280 nm处的吸光值不断增加,说明亚硝酸钠可使包裹在Mb内部的色氨酸与酪氨酸暴露出来,使发射峰增强,即Mb与亚硝酸钠发生了相互作用。本研究在进行肌红蛋白与乳酸钙相互作用的研究中发现,在不同的时间点上Mb在409 nm处的特征吸收峰吸收强度都略有增加,可能是随着时间的增加,肌红蛋白中心Fe2+在空气中被氧化为Fe3+,使吸收峰强度略有增加。乳酸钙处理组吸光度值在409 nm处的峰位几乎没有变化,该现象说明乳酸钙对Mb分子中的血红素辅基影响较小。可能与肌红蛋白的分子结构有关,因为极性氨基酸残基几乎全部分布在分子表面,可与水结合,使肌红蛋白具有可溶性[23]。而非极性氨基酸残基大多分布在分子的内部,使内部呈一个疏水空穴。血红素辅基被包裹在疏水腔中,说明乳酸钙分子未能进入疏水腔内与血红素辅基发生相互作用,可能只是与肌红蛋白外部的氨基酸残基发生了相互作用。

蛋白质的内源荧光主要来源于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)残基。苯丙氨酸的量子产率很低,酪氨酸被电离或者接近氨基、羧基时其荧光几乎全部猝灭[24],肌红蛋白和血红蛋白的核心官能团是heme-Fe2+/3+,位于球蛋白4条肽链折叠而成的亚基之中,由咪唑基团N原子和Fe原子相互配位,并由二硫键(-S-S-)将heme-Fe 与肽链形成稳定结构[25]。肌红蛋白高级结构的荧光光谱显示其heme-Fe2+在597.27 nm处呈现其特征荧光发射峰[26],为五配位高自旋结构。Chou等[27]指出肌红蛋白中铁卟啉环可发射 596 nm的荧光,并有报道研究了金属离子同肌红蛋白的相互作用。研究发现加入一定量的乳酸钙后,597 nm处发射峰强度减弱,随着贮藏天数的增加,发射峰强度继续减弱。用荧光光谱检测肌红蛋白的铁卟啉环的发射峰位置几乎没有发生变化,但它的荧光强度随着贮藏时间的延长而减弱,添加乳酸钙的处理组在0、12、36和72 h比对照组分别下降了4.64%、13.50%、18.30%和18.32%,说明乳酸盐体系与Mb发生了相互作用时更接近色氨酸残基的位置,即对色氨酸残基微环境的影响较大,造成色氨酸残基微环境的极性减弱,疏水性增强,Mb内部疏水结构更加紧凑,肽链的整体延伸程度有所减少[21],但峰图并未发生红移或蓝移现象,说明乳酸钙与肌红蛋白的血红素铁卟啉环并未直接发生反应。

蛋白质二级结构在远紫外(178～250 nm)区具有特征圆二色谱的变化[28],采用远紫外区CD技术检测不同量乳酸钙对Mb的二级结构变化情况。202和222 nm处的2个负槽反映的是的光谱性α-helix质[29]。林凯蕾[30]通过测试血红蛋白在4～40 ℃范围内的变化,发现光谱图的改变不明显,计算值也非常接近。因此温度范围对肌红蛋白CD的分析影响不大,所以本研究中体外孵化在4 ℃模拟冷藏条件下通过CD光谱法观察乳酸钙与肌红蛋白的互作过程是具有一定可靠性的。马静等[21]通过CD光谱研究了Cu2+与Mb的相互作用,发现Mb与Cu2+作用后α-螺旋的含量由64.0%下降到 61.8%,表明金属Cu2+离子诱导Mb的二级结构发生了轻微的改变。本研究结发现在乳酸盐反应体系中加入一定浓度的乳酸钙对肌红蛋白二级结构的影响甚微,远紫外区192、208和222 nm 3个特征峰的形状和肩峰的位置未发生明显改变,190～240 nm处的图谱在乳酸钙处理组中和对照组一样曲线平滑,说明乳酸钙并未与Mb血红素中心Fe原子发生了配位。综上所述,乳酸盐与肌红蛋白血红素辅基的相互作用机制,主要是通过非血红素配体结合的方式对Mb进行调节。

4 结论

采用可见光谱法对冷藏期间牦牛背最长肌肌红蛋白与乳酸盐作用机制进行研究,研究结果表明不同光谱法互相佐证了乳酸盐和Mb的共价加合作用并未发生在血红素辅基上,而是通过非血红素配体结合的方式来调节Mb,说明乳酸盐对牦牛背最长肌的作用机制,进一步为乳酸盐调控肉色的研究方向提供理论基础。