刘静华，陈庆泽，范凯青，马誉旗，郑 纯，刘 主

（韶关学院 英东生物与农业学院，广东 韶关 512005）

生物信息学是一门由分子生物学和计算机信息处理技术结合的，以计算机为工具读取生物信息并进行储存、检索和分析的交叉学科.生物信息学作为一门崭新的交叉学科，在如火如荼的发展中，吸引了越来越多生物学、医学、数学以及具有信息科学背景的专家学者投入其研究当中.近年来，生物信息学的主要研究重点在序列比对、蛋白质结构比对和预测、基因识别非编码区分析、分子进化和比较基因组学、序列重叠群（Contigs）装配、遗传密码的起源、基于结构的药物设计、生物系统的建模和仿真、生物信息学技术方法的研究、生物图像等方面.本文运用生物信息学软件进行ITS序列对比分析，研究草菇的系统分类.

1 草菇的传统系统分类及ITS序列系统分类

草菇别名稻草菇、美味苞脚菇、兰花菇、秆菇、贡菇以及中国菇等.草菇起源于广东韶关南华寺，距今已有300多年的历史.在植物分类学上，草菇属担子菌纲伞菌目是公认的，但关于草菇的科属问题仍存在不同的意见.当前主要有3种不同的分类意见：一是邓树群和张树庭分别把草菇分在鹅膏科苞脚菇属和小苞脚菇属中；二是魏景超则将其归类于伞菌科中；三是Ainsworth等、Singer和Pegler以及毕志树等，主张将其分在光柄菇科的小苞脚菇属，这种说法为现在多数学者所主张［1］.但传统的真菌分类方法是以真菌的形态学特征、生长特征、以及生理生化指标为基础，这些标准分类方法通常需要较长的时间，要进行大量的形态学观察和繁琐的生理生化试验.某些真菌属、种之间的形态学或生理生化差异极其不显著，而且形态特征有时还会受环境因素的影响，采用传统的方法对这些真菌进行分类鉴定是比较困难且准确性较低的.近年来，随着现代分子生物技术和生物信息学等相关技术的发展，运用现代分子生物技术和生物信息学软件对食用菌的单一科、属、种的鉴定研究颇为热门［2-3］.目前应用于真菌分类研究的分子生物学技术主要有限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RELP）［4］、DNA 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）［5］和核糖 rDNA 内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列分析技术［6］、扩增多态性 DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）［7］等 .研究表明，ITS片段的进化速率是18S rDNA的10倍.这是ITS序列在微生物种类鉴定和群落分析的理论基础［8-9］.ITS1和ITS2是中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显.这种特点使ITS适合于菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析.而且ITS的序列分析能实质地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，此外ITS序列片段较小，易于分析，目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中［10-15］.

本文主要利用ClustalX、MEGA5.0等生物信息学软件对草菇及其相近种属的物种进行ITS序列对比分析.考虑到用不同的方法分析一个数据集，如果能产生相似的发育树，则比较可靠，从而选择了距离法中的Minimum Evolution最小进化法（ME）、Neighbor-Joining邻接法（NJ）；特征法中的Maximum likelihood最大拟然法（ML），分别建立系统发育树，从而验证其科属分类问题.

2 材料与方法

2.1 实验材料的序列来源

全部序列来源于美国国立生物技术信息中心（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）的GENBANK数据库.本研究采用4个不同科中的8个属共29条序列材料，具体情况见表1.

表1 NCBI所获得的ITS序列

2.2 研究方法

将从GenBank上所获得的ITS序列（表1），通过序列分析软件BioEdit对其进行编辑，采用多重序列比对软件Clustal X软件进行多序列比对.系统发育树的构建和系统发育研究分析则用MEGA 5.0和PAUP软件，利用Construct Tree中的Neighbor-Joning（NJ）构建NJ树，Maximum-likehihood（ML）构建ML树，Minimum-Evolution（ME）构建ME树.以球盖科的两个物种为外群，并用Bootstrap自展检验1 000次分析分支聚类的稳定性［3］.

3 结果与分析

3.1 ME树及NJ树

最小进化法（ME法）、邻接法（NJ法）同属距离法，当序列同源对比相似度不高，但可判断具有相似性时，推荐选择这两种方法.距离法体现的是序列间的相似程度.图1为依据ME法构建的ME树，图2为依据NJ法构建的NJ树.

图1 Minimum-Evolution（ME）树

图2 Neighbor-Joining（NJ）树

从图1中ME树可知，草菇（Volvariella volvacea）位于小苞脚菇属（Volvariella）的分支上，它与小苞脚菇属内其它物种的相似性达84%以上，其中与银丝草菇（Volvariella bombycina）聚成一个分支，两者相似性达99%以上；草菇与小苞脚菇属中的物种亲缘关系比较近.伞菌科的蘑菇属（Agaricus）和大环柄菇属（Macrolepiota）汇成一个分支，光柄菇属（Pluteus）和鹅膏属（Amanita）的物种则独立形成一个分支.草菇与鹅膏科的部分物种如Limacella glioderma（茶色粘伞）、Amanita virosa（鳞柄白鹅膏）的亲缘关系比较近，相似性达66%，跟光柄菇科的光柄菇属则亲缘关系比较远，相似性仅31%.

从图2的NJ树可知，草菇（Volvariella volvacea）位于小苞脚菇属（Volvariella）的分支上，它与小苞脚菇属内各种的相似性达87%以上，其中与银丝草菇的相似性达99%以上；伞菌科的蘑菇属（Agaricus）和大环柄菇属（Macrolepiota）汇成一个分支，光柄菇属（Pluteus）的所有物种独立形成一个分支.草菇与鹅膏科的部分物种如Limacella glioderma（茶色粘伞）、Amanita virosa（鳞柄白鹅膏）的亲缘关系比较近，相似性达61%，跟光柄菇科的光柄菇属则亲缘关系比较远，相似性仅33%.

3.2 ML树

最大拟然法（ML法）属于特征法，当序列同源对比相似度不高，但不能明显判断是否具有相似性时，推荐选择这种方法.ML法不计算序列间的距离，而是将序列中有差异的位点作为单独特征，根据这些特征来建树.从图3的ML树可知，草菇（Volvariella volvacea）位于小苞脚菇属（Volvariella）的分支上，它与小苞脚菇属内其它物种的相似性达82%以上，其中与银丝草菇（Volvariella bombycina）聚成一个分支，两者相似性达96%以上；草菇与小苞脚菇属中的物种亲缘关系比较近.伞菌科的蘑菇属（Agaricus）和大环柄菇属（Macrolepiota）汇成一个分支，光柄菇属（Pluteus）种则独立形成一个分支.草菇与鹅膏科的部分物种如Limacella glioderma（茶色粘伞）、Amanita virosa（鳞柄白鹅膏）的亲缘关系比较近，相似性达65%，跟光柄菇科的光柄菇属则亲缘关系比较远，相似性仅41%.

图3 Maximum-likehihood（ML）树

4 结论

本文采用生物信息学软件对草菇及其近缘种的亲缘关系进行ITS序列分析，并由此构建系统发育树进行系统发育研究.根据NJ、ME和ML法所建立的系统发育树所得出的结果大致相同，均将草菇归类于小苞脚菇属较为合理，隶属于担子菌门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）光柄菇科（Pluteaceae）.