吴 伟 尤翔宇 黄慧敏 吴晓娟

（中南林业科技大学食品科学与工程学院 稻谷及副产物深加工国家工程实验室 长沙410004）

米糠蛋白的过敏性低，氨基酸组成合理，生物效价高，特别适合开发婴幼儿配方食品，是一种极具开发潜力的优质植物蛋白[1]。然而，米糠极易酸败变质，并且米糠酸败产生的脂质氧化酸败产物具有共价修饰蛋白质的能力，可导致米糠蛋白氧化，进而影响其消化性质[2]。脂质氧化反应极其复杂，其活性产物主要包括脂质自由基和脂质过氧化产物。脂质自由基氧化修饰米糠蛋白的研究已有报道，而脂质过氧化产物对米糠蛋白结构和性质的影响尚不清楚[3]。丙二醛是脂质过氧化生成反应中最主要的产物，具有极高的氧化活力[4]。关于丙二醛氧化其它植物蛋白的研究已证实，丙二醛诱导蛋白质氧化形成的共价交联聚集体会降低其体外胃蛋白酶消化率[5]。另外，米糠蛋白作为一种重要的食品原料，热处理是其加工过程中不可或缺的处理方式。热处理同样会导致蛋白质结构发生变化，进而影响其消化性质，并且绝大多数谷物蛋白加热处理后的消化率都有所提高[6]。由此可见，米糠蛋白加工过程中，氧化修饰和热处理对蛋白质消化性的影响是并存的，而效果可能截然不同。现有研究更多的是从不同氧化体系或不同加热方式来探讨氧化修饰或热处理对蛋白质消化性的影响，而鲜有关于它们共同作用的报道。本文以丙二醛代表米糠氧化酸败中产生的脂质过氧化产物，研究热处理和氧化修饰对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质的影响，以期为开发米糠蛋白及相关健康食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜米糠（酸价小于4 mg KOH/g 油，稻谷品种为籼稻中嘉早17），湖南长沙霞凝国家粮食储备库；1，1，3，3-四甲氧基丙烷，上海Macklin 公司；胃蛋白酶（900 U/mg），Biosharp 公司；肽分子质量标准品[细胞色素C（12 384 u）、抑肽酶（6 511 u）、杆菌肽（1 450 u）、氧化型谷胱甘肽（651 u）、Gly-Gly-Tyr-Arg（451 u）、Gly-Gly-Gly（189 u）]、ABTS，美国Sigma-Aldrich 公司；其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

Sorvall LYNX 6000 高速落地离心机，美国Thermo Fisher 公司；LC-20 液相色谱仪，日本岛津公司；TSKgel SW G2000 SWXL 色谱柱（300 mm×7.8 mm，5 μm），东曹（上海）生物科技有限公司；BlueStar 紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份公司。

1.3 试验方法

1.3.1 米糠蛋白的制备 参考何莉媛等[2]的方法，将新鲜米糠与正己烷按料液比1∶4 混合脱脂，静置30 min 去除上清液，重复脱脂5 次，将沉淀置于通风橱中风干，得到脱脂米糠。将脱脂米糠与去离子水按料液比1∶10 混合，用2 mol/L NaOH 溶液调pH 值至9.0，40 ℃下搅拌反应4 h，将悬浮液在4 ℃，8 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液用2 mol/L HCl 溶液调pH 值至4.0，静置30 min后在4 ℃，8 000 r/min 条件下离心15 min 得到米糠蛋白沉淀。水洗沉淀3 次，将其分散于去离子水中，用2 mol/L NaOH 溶液调pH 值至7.0，冷冻干燥得到纯度为83.75%的米糠蛋白。

1.3.2 丙二醛氧化米糠蛋白的制备 参考Wu等[4]的方法，采用1，1，3，3-四甲氧基丙烷水解法制备丙二醛储液，根据波长267 nm 处的摩尔吸光系数31 500 L/（mol·cm）确定丙二醛浓度。将米糠蛋白溶解于0.01 mol/L pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液中，蛋白质质量浓度为10 mg/mL （含0.5 mg/mL NaN3）。将米糠蛋白溶液与不同体积的丙二醛储液混合，使得丙二醛终浓度分别为0，0.01，0.1，1，10 mmol/L，在25 ℃密封避光条件下中速振荡24 h。反应结束后，置于冰浴中使温度迅速下降到4 ℃以下，随后在4 ℃去离子水中透析72 h，除去未反应的丙二醛，最后冷冻干燥得到丙二醛氧化米糠蛋白，将其置于4 ℃条件下待用。

1.3.3 米糠蛋白羰基、游离巯基和二硫键含量的测定 参考Wu 等[4]方法测定丙二醛氧化米糠蛋白的羰基、游离巯基和二硫键的含量。

1.3.4 热处理丙二醛氧化米糠蛋白 将丙二醛氧化米糠蛋白溶解于去离子水中配制成质量分数2%的悬浊液，在95 ℃条件下水浴30 min 后，在37℃条件下水浴15 min，恒温备用。未经热处理的丙二醛氧化米糠蛋白溶液直接在37 ℃水浴45 min，作为对照组。

1.3.5 热处理丙二醛氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化程度的测定 参考何莉媛等[2]的方法，取1.3.4 节制备的样品，用2 mol/L HCl 溶液调节pH 值到2.0，加入4 U/mg 胃蛋白酶，37 ℃保温酶解1.5 h，沸水浴5 min 终止消化，10 000 r/min 离心10 min 后取上清液，用凯氏定氮法测定上清液中氮含量，计算米糠蛋白的消化率。

1.3.6 热处理丙二醛氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程的测定 参考何莉媛等[2]的方法，取1.3.4 节制备的样品，用2 mol/L HCl 溶液调节pH 值到2.0，加入4 U/mg 胃蛋白酶，37 ℃下保温酶解，分别酶解0，5，10，20，30，40，60，90 min 后，加入终质量分数为15%的三氯乙酸终止反应，随后在4 ℃，8 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液测量波长280 nm 处的OD 值。为表征米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程，参考Bax 等[7]的方法引入拟合指数曲线方程和半衰期方程。

式中，ODmax——消化完全时稳定的最大OD值；β——描述曲线形状系数；t1/2——达到0.5 倍ODmax所需的消化时间，min；t——消化时间，min。

1.3.7 热处理丙二醛氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物分子质量的测定 取1.3.5 节中的上清液配制成0.6 mg/mL 的酶解液，用于测定米糠蛋白消化产物的分子质量分布。参考Chen 等[5]的方法，将肽分子质量标准品配制成质量浓度1 mg/mL 的溶液，经高效液相色谱仪分析得到标准曲线，以保留时间为x 轴，相对分子量的对数为y 轴作分子质量分布曲线：y=-0.2371x+7.1577 （R2=0.9856）。随后将样品过孔径0.22 μm 的醋酸纤维素膜，再采用高效液相色谱仪进行分析。色谱柱：TSKgel SW G2000 SWXL （300 mm×7.8 mm，5 μm）；检测器：紫外检测器；流动相：0.1 mol/L，pH 6.8 含0.1 mol/L Na2SO4的磷酸盐缓冲液；检测波长：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：25 ℃。

1.3.8 热处理丙二醛氧化米糠蛋白酶解物抗氧化能力的测定 取1.3.5 节中的上清液配制成0.6 mg/mL 的酶解液，用于测定米糠蛋白消化产物的抗氧化性。参考何莉媛等[2]的方法，测定米糠蛋白消化产物ABTS+·，DPPH·，·OH，O2-·的清除能力、金属螯合能力以及还原能力。

1.4 数据处理

所有试验平行测定3 次，采用Microsoft Excel 2003 和Origin 7.5 进行数据处理，结果用“均值±标准偏差”表示。指标比较采用最小显著差异法，取95%置信度（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 丙二醛浓度对米糠蛋白氧化程度的影响

羰基含量是衡量蛋白质氧化程度最常用的指标。我国生产的绝大部分米糠毛油的酸值范围在15～40 mg KOH/g，对应制备的米糠蛋白羰基含量约2～10 nmol/mg[3]。本文选用浓度为0，0.01，0.1，1，10 mmo1/L 的丙二醛溶液对米糠蛋白进行氧化修饰，得到羰基含量为2.00～10.34 nmol/mg 的丙二醛氧化米糠蛋白（表1）。由此可见，本文制备的丙二醛氧化米糠蛋白氧化程度与我国大部分米糠制备的米糠蛋白氧化程度相当。丙二醛分子含有2 个羰基，当其中一个羰基与蛋白质分子中的伯胺反应形成烯胺化合物，就会为蛋白质引入羰基；丙二醛还会与蛋白质游离氨基反应生成席夫碱，造成蛋白质羰基化[4]。如表1所示，随着丙二醛浓度的增加，米糠蛋白羰基含量逐渐增加，表明丙二醛可导致米糠蛋白氧化。

半胱氨酸是最易受活性自由基（包括脂质氧化产生的活性醛、酮）氧化修饰的氨基酸之一，并且半胱氨酸巯基的氧化对蛋白质交联及其构象变化起着至关重要的作用[8]。半胱氨酸巯基的氧化状态可分为可逆氧化和不可逆氧化，可逆氧化主要形成二硫键和次磺酸，不可逆氧化主要形成亚磺酸和磺酸。由于羰基含量并不能反映半胱氨酸的氧化状态，因而有必要采用游离巯基和二硫键含量表征米糠蛋白半胱氨酸的氧化程度。如表1所示，随着丙二醛浓度的增加，米糠蛋白游离巯基含量由23.97 nmol/mg 逐渐减小至10.12 nmol/mg，二硫键含量由12.04 nmol/mg 逐渐增加至16.51 nmol/mg。二硫键含量的显著增加，说明丙二醛氧化导致米糠蛋白巯基形成了大量以二硫键交联的共价化合物。此外，游离巯基的下降幅度明显大于二硫键的增加幅度，即总巯基含量也是下降的，说明丙二醛氧化还导致米糠蛋白巯基形成了非二硫键的含硫化合物。游离巯基和二硫键含量变化的结果显示，丙二醛可导致米糠蛋白氧化，并且米糠蛋白的氧化程度随丙二醛浓度的增加而增加。

表1 不同浓度丙二醛氧化米糠蛋白羰基、游离巯基和二硫键含量Table 1 Protein carbonyl，free sulfhydryl and disulfide of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

2.2 热处理对丙二醛氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率的影响

不同浓度丙二醛氧化的米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率如图1所示，随着丙二醛浓度的增加，米糠蛋白消化率逐渐下降。Chen 等[5]研究丙二醛氧化修饰对大豆蛋白体外消化性的影响时发现，丙二醛氧化会抑制大豆蛋白体外胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化，并认为该结果是由丙二醛氧化形成的共价交联聚集体掩蔽了消化酶的识别位点造成的。由图1可知，95 ℃水浴加热处理丙二醛氧化米糠蛋白的体外胃蛋白酶消化率显著高于未加热处理的丙二醛氧化米糠蛋白（P＜0.05）。Zhou 等[9]研究发现，当处理温度由室温升高到100 ℃时，肌原纤维蛋白的胃蛋白酶消化率逐渐升高，并归因于适当温度的热处理可导致蛋白质结构发生变化，空间结构柔性增加，暴露出更多的胃蛋白酶结合位点。此外，随着丙二醛浓度增加，热处理对丙二醛氧化米糠蛋白消化率的提升作用越来越小，由最初的48.29%下降至34.21%。这可能是由于丙二醛具有极高的氧化活力，过高浓度的丙二醛会导致蛋白质形成不易被胃蛋白酶消化的非二硫键交联的共价聚集体，而热处理并不能破坏这类共价键[5，9]。

图1 热处理对不同浓度丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶消化率的影响Fig.1 Effects of heat treatment on pepsin digestibility of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

2.3 热处理对丙二醛氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程的影响

由图2可知，米糠蛋白的体外胃蛋白酶消化进程是一个先快速水解，再缓慢水解直至稳定的过程。通过对消化进程曲线进行拟合，得到拟合曲线参数。由表2可知，随着丙二醛浓度的增加，ODmax逐渐下降，热处理的丙二醛氧化米糠蛋白的ODmax显著（P＜0.05）高于未经热处理的丙二醛氧化米糠蛋白，并且随着丙二醛浓度的增加，热处理对ODmax的提升作用越来越小，与米糠蛋白消化率的变化趋势完全一致。半衰期随着丙二醛浓度的增加而延长，热处理可以显著（P＜0.05）缩短米糠蛋白消化半衰期，表明丙二醛氧化会抑制米糠蛋白体外胃蛋白酶的消化进程，热处理会在一定程度上促进不同浓度丙二醛氧化米糠蛋白的消化进程。由图3可知，随着丙二醛浓度增加，未经热处理的丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶初始消化速率持续下降，热处理的丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶初始消化速率先不变后下降，热处理显著提高相同氧化程度米糠蛋白的体外胃蛋白酶初始消化速率（P＜0.05）。何光华等[10]研究发现，湿热处理会改变蛋白质的高级结构，使原先位于分子结构内部的酶催化位点暴露，进而提高乳清蛋白的消化速率。

图2 热处理对不同浓度丙二醛氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化进程的影响Fig.2 Effects of heat treatment on pepsin digestion process of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

表2 热处理对不同浓度丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶消化进程拟合曲线参数的影响Table 2 Effects of heat treatment on the parameters of the fitting curve of pepsin digestion process of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

图3 热处理对不同浓度丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶初始消化速率的影响Fig.3 Effects of heat treatment on the pepsin initial digestion rate of rice bran protein which oxidatively modified by different concentrations of malondialdehyde

2.4 热处理对丙二醛氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物分子质量分布的影响

体外胃蛋白酶消化过程中，蛋白质消化产物分子质量的变化是一个渐进过程，先降解成月示和胨，再水解成小分子肽。不同浓度丙二醛处理的米糠蛋白消化产物分子质量分布如表3所示，热处理组与未经热处理组的结果差异较大。随着丙二醛浓度增加，未经热处理的米糠蛋白消化产物中分子质量小于500 u 以及500～1 500 u 的短肽含量逐渐下降，分子质量大于8 000 u 的蛋白质含量逐渐增大，可能是因为丙二醛诱导蛋白质氧化形成的可溶性聚集体不易被胃蛋白酶消化降解成短肽。经热处理后，不同浓度丙二醛处理的米糠蛋白消化产物中分子质量小于1 500 u 的短肽均有所增加，尤其是500～1 500 u 的短肽含量显著增加，这表明95 ℃水浴加热处理提高了米糠蛋白的水解程度。Kaur 等[11]和Wang 等[12]的研究发现，适当的热变性可以提高蛋白质的体外模拟胃肠道消化率，生成较多的低分子质量肽。

（续表3）

2.5 热处理对丙二醛氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物抗氧化性的影响

米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物具有抗氧化性已得到广泛证实，并且相比于其它抗氧剂，蛋白质水解产物具有多重抗氧化作用[13]。因而，本文采用自由基清除能力、金属离子螯合能力和还原能力等多种体外抗氧化方法，来评价米糠蛋白消化产物的抗氧化性。随着丙二醛浓度增加，未经热处理的米糠蛋白消化产物的ABTS+·清除率、DPPH·清除率、O2-·清除率、·OH 清除率、Fe2+螯合率和还原能力均持续下降。Chen 等[14]研究发现，蛋白质氧化会降低大豆分离蛋白的总抗氧化力和自由基清除能力。经加热处理的米糠蛋白消化产物的抗氧化性也随着丙二醛浓度的升高而下降，然而总体上要高于未经热处理的米糠蛋白消化产物。Mora等[15]和Wang 等[16]研究发现，热处理后消化产物抗氧化性的提高主要得益于活性肽的增加。此外，Abavominp 等[17]和Wattanasiritham 等[18]研究发现，米糠蛋白抗氧化肽的分子质量主要集中在500～1 800 u 和726～1 578 u 范围内。结合2.4 节米糠蛋白消化产物分子质量分布的结果推断，丙二醛氧化降低了米糠蛋白体外胃蛋白酶消化产物中活性肽（500～1 500 u）的含量，进而导致其抗氧化性下降；热处理提高了相同氧化程度的米糠蛋白胃蛋白酶消化产物活性肽含量，从而提高其抗氧化性。

表4 热处理对丙二醛氧化米糠蛋白胃蛋白酶消化产物抗氧化性的影响Table 4 Effects of heat treatment on the antioxidant properties of pepsin digestive products of malondialdehyde oxidized rice bran protein

3 结论

本文通过构建丙二醛氧化应激环境，诱导米糠蛋白氧化，采用95 ℃水浴热处理，研究热处理对丙二醛氧化米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质的影响。结果表明：丙二醛氧化导致米糠蛋白羰基含量和二硫键含量增加，游离巯基含量下降，表明丙二醛可导致米糠蛋白氧化。随着丙二醛浓度增加，米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率、初始消化速率和消化产物中分子质量分布在500～1 500 u 的活性肽含量均逐渐下降。同时，消化产物的ABTS+·，DPPH·，O2-·，·OH 清除能力、金属螯合率以及还原能力均持续下降。经热处理后，相同氧化程度的米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率、初始消化速率、消化产物的活性肽含量和抗氧化性均有所增加，这表明，丙二醛氧化会降低米糠蛋白的消化性以及消化产物的抗氧化性，适当的热处理会在一定程度上增强米糠蛋白的消化性以及消化产物的抗氧化性。本研究可为开发米糠蛋白及相关健康食品提供一定的理论参考，然而体外消化试验中得到的结论还需要通过体内胃肠消化试验进一步证实，因此，下一步将采用动物模型研究热处理对氧化米糠蛋白营养品质的影响。