李 杨 张 希 李 阳 冯凤琴*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 浙江省农产品加工技术研究重点实验室 浙江省食品加工技术与装备工程中心 农业农村部农产品产后处理重点实验室 杭州310058 2 青岛农业大学食品科学与工程学院 青岛266109 3 云南中医学院 昆明650500）

单甘油月桂酸酯（Glycerol Monolaurate，GML）是一种自然存在的乳化剂[1]，兼具优良的乳化和抑菌功能[2]。1977年，美国食品与药品管理局认定GML 为一般公认安全类（GRAS），2005年我国卫生部批准其应用于各类食品中。GML 也被应用于动物饲料中发挥保健和营养作用。如0.4%GML 可提高断奶仔猪的生产性能，并可抑制仔猪后段肠道中的有害微生物[3]；饲喂GML 提高了肉鸡的生长性能、消化能力和鸡肉营养品质[4]。然而，本实验室前期研究表明GML 在显著促进小鼠增重的同时，引起血脂的异常变化，并诱导了促炎细胞因子升高及肠道菌群紊乱[5]。

益生菌，是一类当摄入足够剂量时，可以对宿主产生有益影响的活的微生物[6]。益生菌的作用与胃肠道紧密相关，总结为3 个层次：1）直接作用于胃肠道（如与肠道菌群相互作用、调节pH 值等）；2）直接与肠黏液层和上皮细胞相互作用；3）影响全身免疫系统或胃肠道外的其它器官[7]。有着悠久使用历史，通常被认为是安全的乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是过去几十年中研究最多的益生菌门类[8]，尤其以乳杆菌属和双歧杆菌属最为常见。植物乳杆菌是一种广泛存在的乳酸菌，该种的一些菌株被证明具有益生特性，如降低胆固醇水平，调节肠道菌群，防治腹泻和调节免疫等[9]。

本研究以雄性C57BL/6 小鼠为研究对象，饲喂添加GML 的基础饲料的小鼠产生显著性增重后，以本实验室分离保存的植物乳杆菌T34 灌胃小鼠，观测其对GML 饲喂小鼠的生长、血脂以及细胞因子等健康相关指标的影响，以期在维持GML 促生长效果的同时，缓解GML 对健康的不利影响，为GML 促进动物生长和健康的应用提供保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 植物乳杆菌ZJUFT34 筛选自传统发酵酸面团中，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.2017342。

1.1.2 实验动物与饲料 4 周龄、体重相近的健康雄性C57BL/6 小鼠27 只，上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养在浙江中医药大学动物实验中心SPF 级实验室。小鼠基础饲料和含150 mg/kg GML 的基础饲料，福贝世亨生物医药（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 植物乳杆菌ZJUFT34 菌粉的制备 将植物乳杆菌ZJUFT34 （T34） 接种于MRS 肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养22 h。取菌液到无菌的离心管中，4 ℃，10 000×g 离心5 min 收集菌泥，用0.85%的无菌生理盐水重悬离心清洗2 次后，菌泥重悬在5%脱脂乳和5%乳糖的冻干保护剂中进行冻干。收集的菌粉菌落总数为3.58×1011CFU/g，用生理盐水配制成1×109～3×109CFU/mL 菌液用于小鼠灌胃，现配现用。

1.2.2 实验设计 小鼠预饲喂1 周后，开始第1阶段实验（饲喂7 周），随机分为2 个实验组，对照CON 组3 笼，每笼3 只小鼠，饲喂基础饲料；GML组6 笼，每笼3 只小鼠，饲喂含GML 的基础饲料。饲喂7 周后，CON 组随机取3 只小鼠，GML 组随机取6 只小鼠，采集血清。随后立即进行第2 阶段实 验，GML 组分为2 组，分别为GML-S 组 和GML-T34 组，处理方式如表1。实验过程中每周称量并记录小鼠体重和饲料摄入量。实验流程见图1。

表1 第2 阶段实验动物分组Table 1 Animal grouping at the second stage

图1 试验流程图Fig.1 Experimental process

1.2.3 小鼠血清的采集 采血前，小鼠禁食（不禁水）过夜（12 h）。禁食结束后，采用眼眶采血方式，收集小鼠新鲜血液，室温静置2 h，4 ℃，3 000 r/min 离心20 min，取上清，分装在1.5 mL 无菌离心管中，于-80 ℃冻藏。

1.2.4 血清脂质相关参数测定 血清中的总甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-CHO）、高、低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C，LDL-C）含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，并计算了HDL-C 与LDLC 的比值。

1.2.5 血清空腹血糖和胰岛素含量测定 血清空腹血糖含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。血清胰岛素的含量采用武汉基因美公司的ELISA 试剂盒测定。并按公式（1）计算稳态模型-IR （Homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）[10]。

1.2.6 血清内毒素（Lipopolysaccharide，LPS）和细胞因子的测定 血清内毒素（LPS）含量采用武汉基因美公司的ELISA 试剂盒测定。血清细胞因子白介素（IL）-1β，IL-6，IL-10，肿瘤坏死因子（TNF）-α，转化生长因子（TGF）-β 含量采用eBioscience公司的ELISA 试剂盒测定。

1.3 数据处理

使用GraphPad Prism version 6 进行数据分析并作图，两组数据比较采用独立样本t 检验，3组数据以上分析采用单因素方差分析并以Tukey’s检验进行多重比较。试验数据以平均值±标准误（MEAN±SEM）表示。以P<0.05 为差异具有统计学意义，以* 表示，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重变化结果

小鼠的生长情况见图2和表2。第1 阶段饲喂过程中，GML 组增重始终高于CON 组，除第3周外，2 组之间均有显著性差异（图2a）；第1 阶段结束时，GML 组小鼠体重（28.44 g）比CON 组小鼠体重（26.17 g）平均增加了2.27 g（表2），且2 组之间的日采食量没有显著性差异。

第1 阶段结束时，CON 组随机取3 只小鼠，GML 组随机取6 只小鼠，采集血液，以此作为后续干预的背景参照。第2 阶段开始时（第7 周开始），GML-S 组和GML-T34 组的小鼠增重均显著高于CON-S 组（图2b），与第1 阶段结果一致，具体体重见表2。第2 阶段，对GML-T34 组的小鼠用T34 灌胃，3 周后各组的增重均没有显著性差异，比第1 阶段任意3 周的增重显著下降，且日采食量也均低于第1 阶段，推测是由灌胃应激导致。虽然第2 阶段3 组间的增重没有显著性差异，但是10 周的体重和第2 阶段的日采食量GML-S 组和GML-T34 组均高于CON-S 组。

本课题组广泛研究了GML 对不同动物生长情况的影响：（1）小鼠：包括本研究在内的试验结果均表明GML 能显著提高小鼠体重[5]；（2）肉鸡：150 mg/kg GML 虽未能增加肉鸡的体重，但对其料肉比有降低的趋势[4]；（3）育肥猪：150 mg/kg GML 剂量的饲料饲喂90日龄的育肥猪67 d，显著增加了日均增重和体重[11]。基于以上结果和报道，150 mg/kg GML 对哺乳动物（小鼠、猪）的生长确有增重的作用。

据报道，植物乳杆菌P8 的摄入能增加肉鸡的体重，且第22～42 天的增重显著高于对照组[12]。Schwarzer 等[13]研究发现，无菌小鼠摄入植物乳杆菌后的生长状况接近于野生型小鼠，说明植物乳杆菌能维持小鼠的生长。本研究后期以灌胃形式给予小鼠3 周T34，其体重增重与未摄入T34 的GML-S 组以及对照CON-S 组无显著性差异，说明3 周T34 的摄入未对体重增加产生显著性影响。由于饲喂7 周时，GML 已引起体重显著性增加，T34 摄入的3 周即使未增加体重，仍旧维持了GML-T34 组体重显著高于CON-S 组的水平 （表2）。

图2 小鼠体重变化Fig.2 Changes of body weight of mice

2.2 对血脂水平的影响

饲喂至7 周时，GML 虽未引起血脂水平的显著性变化，但GML 能增加甘油三酯（TG）、总胆固醇（TCHO）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平，降低高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和HDLC/LDL-C 的水平（图3）。本课题组前期研究表明，同剂量的GML 饲喂小鼠至8 周时，能显著升高TG 和LDL-C，降低HDL-C 水平[5]，本试验的变化趋势与前期研究一致。

7 周时，将取样后的GML 组小鼠随机均分为2 组，GML-S 组和GML-T34 组，继续饲喂3 周，并按照试验设计进行T34 灌胃。至饲喂10 周结束时，饲喂GML 的2 组各项血脂指标与CON-S 组相比仍未见显著性变化，而GML-T34 组的HDLC/LDL-C 比值显著高于GML-S 组（图4）。

LDL-C 能破坏舒血管和缩血管物质的平衡从而促进血栓的形成，进一步促进动脉粥样硬化的形成和发展，而HDL-C 可以通过抑制LDL-C 的氧化修饰进而延缓动脉粥样硬化的发展[14]。Sekiguchi 等[15]研究证明，较高的HDL-C/LDL-C水平显著降低了主要心血管不良反应发生的概率。有研究表明，摄入植物乳杆菌LP91 持续21 d，使SD 大鼠的T-CHO，TG，LDL-C 水平分别降低了23.26%，21.09%和38.13%，并且升高了HDL-C 的水平[16]。在第二阶段，GML 明显降低了HDL-C/LDL-C 比值，此结果提示GML 的使用有潜在的诱导心血管疾病发生的风险；而T34 的摄入使GML 组小鼠的比值显著性升高 （图4e），说明T34 的摄入能有效缓解GML 引起的HDL-C/LDL-C 水平的下降，进而有利于维持小鼠的健康。

2.3 对胰岛素抵抗的影响

小鼠空腹血糖及胰岛素含量结果见图5，3 组的空腹血糖未见显著性差异。GML 能显著提高胰岛素的含量，摄入T34 后，胰岛素含量有所下降，然而仍显著高于对照CON-S 组。HOMA-IR 指数的规律与胰岛素含量相似。

胰岛素抵抗是指单位浓度的胰岛素的细胞效应减弱，即机体组织对胰岛素的敏感性下降，代偿性引起胰岛β 细胞分泌胰岛素增加[17]，它是2 型糖尿病的显著特征之一，并且是最好的预测因子[10]。HOMA-IR（Homeostasis model assessment for insulin resistance）是临床诊断胰岛素抵抗的常用参数。在2 型糖尿病早期，胰岛素水平越高，其胰岛素抵抗程度就越严重。

胰岛素含量的升高和HOMA-IR 指数的升高暗示GML 有可能使小鼠产生胰岛素抵抗，而T34的摄入使这2 个指标的水平都有一定程度的下降，且与CON-S 组的差异有所减少，说明T34 能缓解GML 带来的不利影响。

图4 T34 摄入对小鼠血清脂质水平的影响Fig.4 Effects of T34 administration on serum lipid levels in mice

图5 T34 摄入对小鼠血清胰岛素水平的影响Fig.5 Effects of T34 administration on serum insulin levels in mice

2.4 对血清细胞因子的影响

对小鼠血清脂多糖（LPS，仅第2 阶段）、白介素（IL）-1β、IL-6、IL-10、转化生长因子（TGF）-β、肿瘤坏死因子（TNF）-α 含量进行测定，结果如图6和图7所示。

通过第1 阶段小鼠血清的测定，观察到GML能显著升高促炎细胞因子IL-6 的水平，这种潜在低度炎症的表现表明饲喂GML 至7 周对小鼠有潜在的不利影响。其余4 种细胞因子未观察到显著性变化（图6）。

随后，对饲喂GML 的小鼠分别灌胃生理盐水和T34，相应的对照CON-S 组灌胃生理盐水，3 周后进行血清各指标测定。GML-S 组和GML-T34组的LPS 水平略高于CON-S 组，说明GML 有升高LPS 的趋势，而T34 的摄入未能改变GML 升高LPS 的趋势。GML-S 组的促炎细胞因子IL-1β、IL-6（P<0.05）和TNF-α 水平高于CON-S 组；抗炎细胞因子TGF-β 水平显著低于CON-S 组，IL-10变化较小。

植物乳杆菌的某些菌株具有很好的益生性能，有的已用于临床实验来调节免疫系统和缓解胃肠道疾病[18]。Pothuraju 等[19]研究表明，植物乳杆菌NCDC 625 能显著降低高脂膳食引起的IL-6和TNF-α 转录水平的升高。在本试验中，GMLT34 组的各细胞因子水平与其余2 组间均没有显著性差异 （图7），而摄入T34 降低了IL-6 和TNF-α 水平且升高了TGF-β 水平，使之更接近于对照CON-S 组，说明T34 能缓解GML 引起的IL-6 水平升高和TGF-β 水平降低的趋势。GMLT34 组的促炎细胞因子IL-1β 水平与GML-S 组相似，说明T34 对此细胞因子的影响小于GML。

图6 GML 对小鼠血清细胞因子水平的影响Fig.6 Effects of GML on serum cytokines levels in mice

图7 T34 摄入对小鼠血清细胞因子水平的影响Fig.7 Effects of T34 administration on serum cytokines levels in mice

3 结论

本研究表明，饲喂GML 可以使小鼠体重显著增加，并能引起胰岛素抵抗以及低度炎症。GML增重作用适用于在动物生产中提高其生产性能，然而其诱导的低度炎症反应以及血脂异常为GML 应用带来潜在危害。本文尝试使用一株植物乳杆菌ZJUFT34 对GML 的不良反应进行调节，植物乳杆菌ZJUFT34 的使用在保持GML 增重效果的同时，有效改善了血脂指标，优化了胆固醇的组成（提高了HDL-C/LDL-C 的水平），缓解了胰岛素抵抗，降低了促炎细胞因子IL-6，并上调了抗炎细胞因子TGF-β 的水平，很大程度上减轻了GML带来的不利影响。GML 和植物乳杆菌ZJUFT34 配合使用，既保留了GML 促进生长的特点，又改善了机体血脂、胰岛素和炎症反应等指标，维持了机体健康，使其在动物养殖上具有良好的应用前景。