许 女 贾瑞娟 李雅茹 张 浩 王如福

（山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801）

益生乳酸菌作为一种调节机体肠道菌群生态平衡的有益菌，其生理功能是多方面的，主要表现在调节肠道菌群，改善肠上皮细胞屏障功能，调节免疫应答，拮抗病原微生物，促进消化吸收，降低血清胆固醇及参与宿主的物质代谢等，目前被广泛应用于食品、医药和工业发酵中。关于益生乳酸菌的筛选及开发研究多集中在乳制品、发酵肉制品、泡菜、酒、青贮饲料及人体肠道等方面。研究表明，乳酸菌是山西老陈醋整个发酵过程中的优势细菌菌属，具有抑制杂菌，产生乳酸（老陈醋第2主体酸成分，第1 主成分为醋酸）、乙偶姻（老陈醋重要功能成分川芎嗪的前体），平衡酸味，丰富协调香气，增强食醋生理功能等重要作用[1]，而目前鲜有关于老陈醋中乳酸菌资源的益生特性及开发应用的报道。

乳酸菌作为食品发酵剂具有悠久的使用历史，一直以来被认为是安全的 （Generally recognized as safe，GRAS），而近些年来关于传统发酵食品来源乳酸菌安全性的负面报道时有发生，一些研究表明部分乳酸菌可携带抗性基因转移至病原微生物[2]，引起耐药性问题；一些双歧杆菌具有体外降解粘蛋白的毒力能力[3]；随着研究的深入，发现某些菌株能够产生生物胺等有害代谢产物[4]。开展乳酸菌的安全性评价，对提高乳酸菌制品的质量安全以及保证人体健康具有重要意义。本文主要对山西老陈醋源乳酸菌进行益生特性筛选和系统安全评价，为其开发应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

健康昆明小白鼠，山西西科大学实验动物研究中心，清洁级，体重（20±2）g。

乳酸菌菌株，分离自山西老陈醋醋醅，山西农业大学食品科学与工程学院，生物工程实验室保存；MRS 培养基，北京陆桥技术有限责任公司；胆盐、胆固醇、DPPH、血管紧张素转化酶（ACE）、生物胺、γ-氨基丁酸（GABA）、乙偶姻，北京索莱宝科技有限公司。细菌提基因组试剂盒，北京博迈德科技发展有限公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）反应缓冲液、10×Loading Buffer，大连宝生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的益生特性测定 乳酸菌菌株的耐酸、耐胆盐特性，DPPH、胆固醇的清除能力，ACE抑制活性，生物胺降解能力及产细菌素、γ-氨基丁酸和乙偶姻等益生特性试验参考文献[5-7]中报道的方法。

1.2.2 菌株的安全评价

1.2.2.1 毒力、产生物胺及耐药相关基因的PCR扩增 参考文献[8-9]等的引物序列，采用PCR 方法对20 株老陈醋源乳酸菌的毒力基因、生物胺产生相关基因及耐药基因进行检测，引物序列及扩增片段长度见表1。

1.2.2.2 菌株有害代谢产物评价 吲哚试验、硝酸盐还原酶、氨基脱羧酶活性、D-乳酸检测参考文献[10]中报道的方法。

1.2.2.3 菌株动物毒性实验

1）受试菌液的制备 将试验菌株按3%的接种量接于MRS 液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，8 000 r/min，离心10 min，弃上清液，加入无菌生理盐水，将菌体细胞洗涤2 次，调OD 值，使菌液浓度为1010CFU/mL 和108CFU/mL。

2）急性毒性实验 将健康昆明小白鼠，分为4 组，每组12 只，雌雄各半，分别是对照组、植物乳杆菌172 组、植物乳杆菌173 组、发酵乳杆菌179 组。对照组灌胃0.85%的无菌生理盐水，乳酸菌试验组灌胃受试菌液，灌胃浓度为1010CFU/mL，剂量为0.5 mL/d。灌胃前1 d 小鼠禁食16 h，

不限饮水。灌胃后1，3，5，7 d 记录小鼠体重变化，一般表现、行为及中毒表现。一般表现、行为及中毒表现主要包括：行为、动作、各种刺激反应、瞳孔大小、鼻孔、呼吸、粪便硬度、粪便颜色、皮毛、眼球、姿势等。

3）30 d 喂养试验 将健康昆明小白鼠分为7 组，每组8 只，雌雄各半，分别是对照组（灌胃0.85%的无菌生理盐水）、植物乳杆菌172-1010组，植物乳杆菌172-108组（灌胃的受试菌液浓度分别为1010CFU/mL 和108CFU/mL，灌胃剂量为0.2 mL/d）、植物乳杆菌173-1010组、植物乳杆菌173-108组和发酵乳杆菌179-1010组、发酵乳杆菌179-108组。连续灌胃30 d，每天灌胃1 次，每天灌胃时间相同。

表1 乳酸菌菌株的毒力基因、产生物胺基因及耐药基因的PCR 引物Table 1 Primer sequences of virulence factors，biogenic amine producing and antimicrobial resistance genes of lactic acid bacteria

每天记录小鼠的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1 次体重。将上述小鼠在第31天于无菌环境下解剖，在无菌范围内用灭菌的手术刀将各个脏器切开，用无菌棉签擦拭脏器剖面，涂布于MRS 固体培养基，37 ℃培养48 h，观察有无菌落生长；将各个脏器在无菌范围内制备成组织抹片，进行革兰氏染色，镜检，观察有无细菌易位现象。

对肝、肾、脾、心、肺称重，制作石蜡切片，进行组织染色观察。

2 结果与分析

2.1 菌株的16S rDNA 系统发育树构建

分离自山西老陈醋醋醅中的20 株乳酸菌的16S rDNA 系统发育树如图1所示。其中5 株植物乳杆菌 （L.plantarum），5 株发酵乳杆菌 （L.fermenti），3 株戊糖片球菌（P.pentosaceu），2 株淀粉乳杆菌（L.amylovorus），3 株短乳杆菌（L.brevis）和2 株干酪乳杆菌（L.casei）。

图1 基于16S rDNA 序列的20 株乳酸菌进化树Fig.1 Dendrogram of LAB isolates based on 16S rDNA sequence

2.2 菌株的益生特性

本试验对分离自山西老陈醋醋醅中的20 株乳酸菌菌株的耐酸、耐胆盐特性，DPPH、胆固醇的清除能力，ACE 抑制活性，生物胺降解能力及产细菌素、γ-氨基丁酸和乙偶姻等益生特性进行研究，以期扩大其应用范围，试验结果见表2。益生菌必须对人体消化系统分泌的胃液、胆汁和胰液等消化液具有一定的耐受性。由表2可知，20 株乳酸菌菌株都表现出一定的酸和胆盐耐受性，其中，植物乳杆菌171，172，173，175 和发酵乳杆菌178，179 的耐受性强于其它菌株，在模拟胃液（pH 2.0+0.1%胃蛋白酶）和模拟肠液（pH 7.0+0.1%牛胆盐）中分别消化2 h 和24 h 后，活菌数仍然保持在106CFU/mL 左右。并且植物乳杆菌172，173 和发酵乳杆菌179 这3 株菌在后续筛选试验中都呈现出良好的益生特性，具有较高的DPPH（65.35%，68.12%，60.38%）、胆固醇的清除能力（55.56%，60.52%，57.81%），血管紧张素转化酶抑制（ACEI）活性（83.12%，80.05%，79.35%），生物胺降解能力（68.52%，60.32%，52.00%）及产细菌素（12800，12800，6400 AU/mL）、γ-氨基丁酸（0.92，1.03，0.99 g/L）和乙偶姻（0.35，0.52，0.37 g/L）的能力。

研究结果发现，大部分醋源乳酸菌的耐酸特性都较强，尤其是植物乳杆菌，这与种属（植物乳杆菌的基因组通常较大，为3.35 Mb，而其它乳酸菌菌株的基因组为1.8～3.2 Mb，基因组大则可能含有的代谢及耐受基因数量多，表现出对外界不良环境适应性和抵抗性较其它菌属强） 和所处的酿醋环境（醋醅pH 值为3 左右）对菌株的驯化作用有关。

老陈醋酿造的前期是酒精发酵，特别是在苹果酸、乳酸发酵这一步，由于微生物（大部分酵母菌和一些细菌） 氨基酸脱羧酶的作用产生大量生物胺，经醋酸发酵后，使得生物胺的含量有所降低（具有降解生物胺能力的乳酸菌和醋酸菌）[11]，然而仍有部分生物胺残留在最终的醋产品中，引起食品安全隐患。很多学者致力于研究具有降解生物胺能力的乳酸菌的筛选，并成功地应用于发酵酒类、泡菜、肉制品生产中[12-13]，而鲜有关于醋源降生物胺乳酸菌的筛选及强化应用在陈醋生产中的相关报道。

乳酸菌细菌素，作为一种抑菌蛋白，成为近年来乳酸菌界的研究热点。乳酸菌作为老陈醋生产过程中的优势菌属，除了具有产酸、协调香气、平衡风味等重要作用，抑制有害杂菌是其另一重要功能，尤其在漫长的大曲制备（1 个月）、成熟过程中（3～6 个月），抑制杂菌生长、繁殖，保证主要功能菌群如霉菌、酵母菌和乳酸菌作为优势菌。将产细菌素的乳酸菌菌株应用到大曲制备中，对保证、提高成品曲的质量，降低食品安全风险具有重要意义。

川芎嗪，具有多种生物和药理活性，被广泛应用于心脑血管疾病、肾病、儿科疾病等病症的临床治疗，是山西老陈醋的特征功效成分。乙偶姻是生成川芎嗪的重要前体物质，陈醋发酵过程中乙偶姻形成的代谢途径和影响因素非常复杂，其中涉及到的主要菌种有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和芽孢菌[14-15]。本文主要对老陈醋生产中高产乙偶姻的乳酸菌进行筛选，为今后将其强化应用在功能食醋产品开发上提供基础研究。

氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是山西老陈醋中又一重要潜在功能因子，具有改善神经功能、脑机能，抗癌，抗心律失常，健肝利肾等多种功效，已成为一种新型活性因子，广泛应用于医药与食品领域并成为研究热点。乳酸菌以谷氨酸或其盐类为底物通过谷氨酸脱羧酶对底物进行脱羧从而合成GABA，是GABA 重要的生物合成方式，已经将其应用在功能酸奶、干酪、饮料、面包上，然而未见其应用在生产高附加值功能醋产品的报道。老陈醋以高粱、大麦等谷物为主要的生产原料，研究报道采用乳酸菌发酵谷物会产生大量GABA，这就使食醋作为富含GABA 的功能载体，与其它产品形式相比，具有不用额外添加底物谷氨酸盐、辅酶磷酸吡哆醛、谷氨酸脱羧酶等优势，体现出良好的研究应用价值。

2.3 菌株的安全评价

近年来，乳酸菌安全性问题得到广泛关注，传统乳酸菌由于悠久的食用历史，一直被认为是安全的（GRAS）。然而，有研究表明能够从一些患者体内分离出乳酸菌，可能与菌血症、心内膜炎、尿道感染等疾病有关。由于毒性及感染性因子具有菌株特异性，因此，对于新的具有潜在益生作用的乳酸菌菌株都必须进行安全评价。本文主要从毒力因子、耐药性、有害代谢产物产生及体内毒理实验等方面，对20 株醋源乳酸菌菌株进行了较系统的安全评价。

2.3.1 菌株的体外安全评价 根据国际上关于乳酸菌安全评价体系的内容，毒力因子的检测非常必要，因为这些基因经常位于结合性质粒上，益生乳酸菌中携带的毒力基因可能来自于其它致病菌，如某些肠球菌，也可能水平转移到其它菌种中，造成食品安全隐患。

asa1（聚合物，Aggregation substance）、esp（肠球菌表面蛋白，Enterococcal surface protein）和ace（黏附胶原，Adhesion of collagen）属于黏附型毒力因子。聚合物的定植作用是致病菌感染宿主细胞最为关键的一步，有了这种黏附作用，肠球菌不仅可以调节自身的聚集也能促进肠球菌在宿主细胞上的定植，便于肠球菌感染宿主细胞[16]。gelE（ 明 胶 酶，Gelatinase）、hyl （ 透 明 质 酸 酶，Haluronidase）、cylA（细胞溶素，Cytolisin）属于分泌型毒力因子。编码明胶酶的基因gel 位于染色体上，约为1 520 bp，明胶酶不仅参与生物膜的形成过程，也降解宿主体内的胶原蛋白、纤维蛋白、抗菌肽和补体等，使机体的免疫系统遭到破坏，也可使肠球菌扩散或转移至体内其它位置，增加感染几率[17]。细胞溶素（Cytolisin），又名β-溶血素（βhemolysin），是革兰氏阳性菌所产生的一类二肽物质，对原核生物和真核生物都能产生毒害作用，细胞溶素在动物体内的致病作用已有相关报道[18]。研究发现细胞溶素基因和聚合物基因通常位于同一个质粒上[19]，因此，肠球菌在合成细胞溶素的同时，也往往能够生成聚合物。表3结果显示，仅在2 株乳酸菌中检测出hyl 基因，分别是植物乳杆菌175 和发酵乳杆菌180，另外一株戊糖片球菌183和干酪乳杆菌189 显示出ace 阳性，其它毒力基因均未被检出。

抗药性是乳酸菌安全评价的重要内容。由于抗生素的不当使用，越来越多的乳酸菌具有耐药性，或者携带耐药基因，大部分耐药基因位于可移动的非染色体遗传因子上，可通过水平转移进而传递给其它肠道菌株，甚至是致病菌中，导致超级耐药细菌的产生，给人类的健康带来严重危害。为初步探究乳酸菌的耐药机制，本文检测了大环内酯-林肯酰胺类（ermB，lnuA）及四环素类（tetM）、氨基糖苷类 （aac （6′）-aph （2″））、β-内酰胺类（blaZ）、和万古霉素（vanX）等抗生素耐性基因在20 株醋源乳酸菌中的分布情况。表3结果显示，ermB 和tetM 的检测率较高，分别达到70%（14/20） 和65%（13/20），2 株淀粉乳杆菌显示出blaZ和vanX 呈阳性，另外还有2 株干酪乳杆菌189、190 包含以上检测的所有耐药基因，为多重耐药菌株。目前，关于乳酸菌的耐药性研究主要集中在动物源、乳及乳制品中的分离菌株，鲜有关于传统发酵食品如发酵肉类、泡菜、醋中乳酸菌的耐药性研究报道[20]。本文研究结果显示醋源乳酸菌的耐药性可能成为食品安全隐患，除了加强禁止抗生素滥用规定外，应重视传统发酵食品菌株的安全评价，今后需对耐药质粒检测，转移机制、途径等作进一步系统研究。

有害代谢产物的产生是乳酸菌安全评价的又一重要内容，包括氨基脱羧酶活性、硝酸盐还原酶活性吲哚试验及D-乳酸生成等。一些乳酸菌具有氨基酸脱羧酶活性，它们能够将食品中的氨基酸脱羧还原成生物胺类物质，若胺类物质在体内积累过多，则会引起中毒症状。

如表3所示，7 株菌中含有编码酪氨酸脱羧酶的tdc 基因，5 株菌含有odc （鸟氨酸脱羧酶）基因，并未检测出hdc（组氨酸脱羧酶）基因。并且在大多数阳性菌株中，含有tdc 基因的菌株同时携带odc 基因，如植物乳杆菌175 和3 株短乳杆菌186，187，188，这与栾同青[21]对黄酒酿造过程中分离的乳酸菌的检测结果相似。试验还进一步采用脱羧酶培养基检测了菌株产生物胺的表型情况，试验结果与PCR 结论一致（数据未给出）。孟甜[22]对26 株乳酸菌的检测结果显示其中6 株菌基因显示阳性，而表型却显示阴性。脱羧酶培养基中加入了氨基酸前体物质，可以专一性的检测到不同脱羧酶的活力，然而该方法易受外界因素的影响，如显色剂、葡萄糖浓度、诱导剂、pH 值、氯化钠浓度、氧气等，也可能出现基因突变或基因“沉默”现象。报道称产生物胺的乳酸菌分布在不同的种属间，然而并无种属特异性，因此必须对传统发酵食品来源乳酸菌进行生物胺相关检测，确保其安全使用。

硝酸盐还原酶可以将食物中含有的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐可与食品中蛋白质分解产生的中间产物仲胺反应形成亚硝胺，亚硝胺可诱发多种癌症。过量摄入D-乳酸或DL-乳酸则有可能引起代谢紊乱，甚至导致中毒。本试验中所有菌株吲哚试验、硝酸盐还原酶、D-乳酸试验均为阴性。

表2 食醋来源乳酸菌菌株的益生特性Table 2 Probiotic character of LAB isolates from Shanxi aged vinegar

表3 食醋来源乳酸菌菌株的体外安全性评价Table 3 Safety assessment in vitro of LAB isolates from Shanxi aged vinegar

2.3.2 菌株的体内安全评价

2.3.2.1 急性毒性试验 在毒理学实验中，受试动物的体重变化是机体各器官、系统发育状况的总和，是反应受试物对机体影响的一项综合性指标，可以作为评价受试物对机体影响的一项重要指标。本试验以1010CFU/mL 的浓度分别灌胃小鼠，观察7 d，各组小鼠生长、行为和精神状况良好，皮毛整洁光泽，饮食、粪便等均正常，未见明显的中毒症状，无死亡。各组体重增加趋势如图2所示，各试验组小鼠体重增长趋势正常，7 d 平均体重增长3.7～4.8 g，灌胃不同试验菌液的试验组小鼠体重与对照组相比，均无显著性差异（P>0.05）。

2.3.2.2 30 d 喂养试验 3 株试验菌株的高剂量（1010CFU/mL）和低剂量（108CFU/mL）分别灌胃实验小鼠30 d，各组小鼠的一般表现、行为和精神状况良好，摄食、饮水、排泄正常，未见明显的中毒表现，无死亡。体重增长正常，如图3所示，试验菌株各剂量组小鼠第1 周到第2 周平均体重增长3.6～5.3 g，以后每周体重增加趋于稳定，每周平均体重增长1～2.5 g，各剂量组小鼠30 d 平均体重增长8～11 g。经方差显著性分析，均无显著性差异（P>0.05）。在关于乳酸菌对小鼠体重影响的研究中[23-24]，体重升高和降低皆有报道，可能与菌株特异性（某些乳酸菌具有减肥功效，而乳酸菌也具有促进食欲，帮助消化，营养吸收，增加体重的功能）及灌胃剂量、试验周期有关。

图2 急性毒性试验中菌株对小鼠体重的影响Fig.2 The weight growth trends of mice for acute toxicity test （7 days）

脏器指数是各脏器与体重的一个比值，是毒理实验中常用的指标，正常时比较恒定，当毒性反应发生后，受损脏器质量可以发生相应改变，故脏器指数也随之改变。当脏器充血、水肿或增生肥大时，脏器指数增大。脏器萎缩及其它退行性病变时，脏器指数减小。30 d 喂养结束后对小鼠进行大体解剖，各组织器官正常，未见器质性病变，各脏器颜色正常，质软，无肿块。各试验菌株对各组织器官的影响见表4和图4所示，3 株试验菌株及生理盐水对照组的各试验组小鼠的肾体比、脾体比、肺体比、肝体比、心体比与对照组小鼠相比，均无显著性差异（P>0.05）。

由图4可以看出，各组小鼠肝脏、肾脏、脾脏无异常变化。镜下可见肝细胞无肿胀，肝小叶界限清楚，血窦内无充血现象，无异常细胞出现。镜下可见肾小体毛细血管无异常改变，管壁细胞无肿胀，巧窠界限清晰。远曲小管、近曲小管边界清楚。髓质区各种小管整齐排列、分布。脾脏组织结构清晰，红、白髓界限分明，白髓成熟淋巴细胞丰富，内含较多淋巴小结，脾索和脾窦排列整齐。综上可见，肝脏、肾脏、脾脏均无任何特异性病理改变，说明灌胃试验菌株对小鼠各组织器官无影响。

细菌易位是指原存在于肠腔内的细菌过度繁殖，在肠黏膜屏障损害和机体免疫防御功能低下等情况下，通过某种途径越过肠黏膜屏障，进入肠系膜淋巴结、门静脉系统，继而进入体循环以及肝、脾、肺等远隔器官的过程，从而激发全身性炎症反应，导致脓毒症，多脏器功能不全，甚至多脏器功能衰竭[25]。本文采用涂布的MRS 固体培养基和细菌抹片经革兰氏染色镜检方法，考察3 株菌的易位情况，结果发现各个器官中均未见乳酸菌的生长，故无细菌易位现象发生。然而在肠道疾病或免疫力低下等情况下，是否会发生细菌易位，还有待进一步研究。

图3 30 d 喂养试验中菌株对小鼠体重的影响Fig.3 The weight growth trends of mice for toxicity test （30 days）

表4 30 d 喂养试验试验菌株对小鼠脏器的影响Table 4 The internal organ indices of mice for toxicity test （30 days）

图4 30 d 喂养试验小鼠脏器组织切片Fig.4 The organs tissue sections of mice for toxicity test （30 days）

3 结论

本文主要对20 株分离自山西老陈醋醅中的乳酸菌菌株进行了DPPH、胆固醇清除、生物胺降解、ACE 抑制等益生活性及产细菌素、γ-氨基丁酸和乙偶姻等功能活性代谢产物能力筛选，从中筛选出3 株优良益生乳酸菌菌株：植物乳杆菌172，173 和发酵乳杆菌179。体外安全评价试验及小鼠毒理实验进一步证明了这3 株菌的安全性，为将其开发成益生菌制剂提供了基础数据。另外，试验结果还表明，这20 株分离自醋醅的乳酸菌菌株中，耐药基因ermB 和tetM 的阳性率达到65%以上；部分菌株携带氨基酸脱羧酶基因；还有少量菌株含有hyl、ace 等毒力基因，因此对传统发酵食品来源的乳酸菌菌株作安全评价十分必要。