岳 颖 严 斌，2 刘丽娅 庞淑婕 周闲容 佟立涛 王丽丽 周素梅*

（1 中国农业科学院农产品加工研究所 农业部农产品加工重点实验室 北京100193 2 湖南省农林工业勘察设计研究总院 长沙410007）

近年来，伴随着人们生活水平的提高及饮食习惯的变化，腹泻等肠道疾病的发生率逐年增加。研究发现，腹泻的发生与肠道屏障受损（肠上皮损伤）密切相关[1]。Caco-2 细胞源于人结肠癌细胞，结构和功能与人体肠上皮细胞类似，是研究某些食品或药品对肠道屏障保护作用的经典模型[2]。机体受到外界严重刺激后，体内的活性氧等因子剧增，氧化还原体系失衡，导致机体组织发生氧化应激损伤[3]。肠道是机体受到外界刺激最为频繁的器官之一。氧化应激能通过多种途径破坏肠上皮细胞，导致肠上皮屏障功能障碍。

值得关注的是，小麦蛋白中富含谷氨酰胺（Gln），而Gln 在维持肠道粘膜结构完整性、促进肠上皮细胞增殖中发挥着不可替代的作用[4]。天然小麦蛋白溶解性和消化吸收性差，通过体外生物酶解技术可有效提高其生物利用性[5]。以往的研究表明小麦蛋白经酶解制备的低聚肽对肠上皮细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用[2]。

蛋白水解物被人体摄入后，体内的蛋白酶会对其进一步消化降解，进而可能会影响其生物活性[6]。然而，目前对于小麦蛋白水解物消化前、后抵御肠上皮细胞氧化应激能力的变化未见报道。本文采用H2O2诱导Caco-2 细胞建立氧化应激损伤模型，用富含Gln 的小麦蛋白水解物样品及其体外模拟消化产物对细胞进行预处理，通过对细胞存活率和CAT，GSH，MDA，SOD 等细胞抗氧化指标的检测，研究不同小麦蛋白水解物及其体外模拟消化产物对肠上皮细胞抵御氧化应激损伤的作用效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦蛋白 （俗称谷朊粉），粗蛋白含量为74.10%，安徽瑞福祥食品有限公司。

XS 蛋白酶（食品级），宁夏夏胜实业集团有限公司；Protamex 蛋白酶（食品级）、Alcalase 蛋白酶（食品级），诺维信（中国）生物技术有限公司；Caco-2 细胞，中科院细胞库；过氧化氢（H2O2）（分析纯级），天津市大茂化学试剂厂；DMEM/F12 培养基、胎牛血清（FBS）均为分析纯级，美国Gibco 公司；细胞培养瓶/板，美国Corning 公司；超氧化物歧化酶 （SOD） 试剂盒、微量还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒均为分析纯级，南京建成生物工程研究所；其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

MCO-20AIC 二氧化碳培养箱、MLS-3750 高压蒸汽灭菌锅，日本SONYA 公司；ZHJH-C 超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；BX50荧光显微镜，日本Olympus 公司；CKX41SF 倒置显微镜，日本Olympus 公司；BS-2F 振荡培养箱，常州国华电器有限公司；BIORAD iMark 酶标仪，美国BIO-RAD 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小麦蛋白水解物的制备及组成分析

1）小麦蛋白水解物的制备 锥形瓶中加入蒸馏水，添加蛋白酶后封口，于50 ℃磁力搅拌器内预热10 min；打开封口并在搅拌过程中缓慢加入一定量的小麦蛋白，20 min 内加完，形成一定底物浓度的蛋白溶液；以实验室前期研究为基础，采用双酶及三酶复合酶解工艺分别制备小麦蛋白水解产物PWGH 和AWGH。具体工艺流程为：PWGH 酶解工艺：XS 蛋白酶（1.00%）+Protamex蛋白酶 （0.25%）；AWGH 酶解工艺：XS 蛋白酶（1.00%）+Protamex 蛋白酶（0.25%）+Alcalase蛋白酶（0.30%）；底物质量分数为20%，加酶量以酶与底物的质量比计。在双酶酶解时，XS 和Protamex 同步加入，无需调节体系pH 值；三酶酶解时，先加入XS 和Protamex，在自然pH 值下反应3 h 后，调节pH 值至8.5 后加入Alcalase。酶解结束后，100 ℃沸水浴灭酶10 min，冰水浴中迅速冷却，酶解产物先经4 000 r/min 离心10 min 后取上清液冻干，备用。

2）小麦蛋白水解物基本指标测定 短肽含量的测定参考GB/T 22492-2008《大豆肽粉》中附录B《肽含量的测定方法》并略有修改；Gln 含量测定采用BTI 衍生法[7]。

1.3.2 小麦肽体外模拟消化产物的制备及水解产物分子质量分布

1.3.2.1 体外模拟消化流程 样品溶液（5%，质量分数）→1 mol/L HCl 调节pH 值至2.0→加胃蛋白酶（2%，质量分数） 在37 ℃消化2 h→0.9 mol/L NaHCO3调节pH 值至5.3 →1 mol/L NaOH 调pH 值至7.5→加胰蛋白酶（4%，质量分数），在37℃消化2 h→100 ℃灭酶10 min→4 000 r/min 离心10 min→取上清冷冻干燥→消化后样品。

1.3.2.2 分子质量分布测定 分子质量分布测定采用凝胶过滤色谱法[7]。称取适量样品用去离子水溶解，经0.45 μm 微孔膜过滤后上凝胶色谱柱，色谱条件如下：

色谱柱：TSKgel G2000 SWXL （300 mm×7.8 mm）；流动相：乙腈∶水∶TFA=45∶55∶0.1（体积比）；检测：UV 220 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：30 ℃。

以Gly-Gly-Gly （Mw 189 u）、Gly-Gly-Tyr-Arg（Mw 451 u）、杆菌肽（Mw 1 450 u）、抑肽酶（Mw 6 500 u）、细胞色素C（Mw 12 500 u）为标准品，通过色谱柱后记录保留时间，作相对分子质量校正曲线，得到相对分子质量与保留时间的回归方程y=-0.2378x+6.9472（R2=0.9866），进而预测样品的相对分子质量分布。

1.3.3 细胞复苏与培养 参考文献[8-9]方法，并做适当调整。将冻存细胞于37 ℃恒温水浴锅中尽快融化，彻底融化后转移至无菌离心管中，2 000 r/min 离心，弃上清，用含20%胎牛血清的完全培养液悬浮细胞，转移至细胞培养瓶中并补全液体，置于37 ℃恒温培养箱中培养。待细胞贴瓶后换液1次，继续培养。

待细胞长满瓶底80%左右，弃去旧培养液，用D-Hanks 平衡盐溶液进行漂洗后，加入0.25%的胰蛋白酶消化至细胞皱缩变圆，弃去胰蛋白酶液，用DMEM/F12 培养基（10%胎牛血清）吹打细胞制成悬液，并接种至2 个细胞培养瓶中，补全液体，置于37 ℃恒温培养箱中培养。

待细胞生长至对数期，消化细胞，制成细胞悬液并调整密度至5×105个/mL。将细胞悬液充分吹打混匀后，接种至24 孔培养板（1 mL/孔）或96 孔培养板（200 μL/孔），置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，每隔2 d 换液1 次，直至细胞相互融合，长满单层。

1.3.4 H2O2诱导的Caco-2 细胞氧化应激损伤模型建立 通过显微观察和细胞存活率测定，确定模型建立所需要的H2O2浓度。方法如下：

24 孔培养板细胞生长至对数期后，分别添加含不同浓度H2O2的DMEM/F12 培养基（10%胎牛血清）进行处理（H2O2添加浓度为0～2 000 μmol/L），置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中继续培养2～8 h，显微镜观察。

96 孔培养板细胞生长至对数期后，分别添加含不同浓度H2O2的DMEM/F12 培养基（10%胎牛血清）进行处理（H2O2添加浓度分别0，200，400，800，1 600，3 200 μmol/L）。置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中继续培养4 h，然后用MTT 法测定细胞存活率。

1.3.5 小麦肽对氧化应激损伤细胞存活率的影响接种后细胞生长至对数期时，加入5 种小麦肽（PWGH，PWGHH，AWGH，WGHH，WGH），添加终质量浓度分别为0，0.5，1，2，4 mg/mL 的DMEM/F12 培养基（10%胎牛血清），置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养24 h，用PBS 洗涤细胞以去除残留样品，然后添加含2 mmol/L H2O2的DMEM/F12培养基（10%胎牛血清）进行处理（空白对照组不添加H2O2），置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中继续培养4 h，用MTT 法测定细胞存活率[9]。

1.3.6 小麦肽对氧化应激损伤细胞抗氧化能力的影响 接种后细胞生长至对数期后，加入5 种小麦肽（PWGH，PWGHH，AWGH，AWGHH，WGH），添加终质量浓度分别为0，2 mg/mL 的DMEM/F12培养基（10%胎牛血清），置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养24 h，用PBS 洗涤细胞以去除残留样品，然后添加含2 mmol/L H2O2的DMEM/F12培养基（10%胎牛血清）进行处理（空白对照组不添加H2O2），置于37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中继续培养4 h，弃去旧培养液，用PBS 洗涤细胞以去除残留的H2O2后，收集细胞，将细胞超声破碎后取得细胞裂解液。采用南京建成试剂盒对细胞裂解液的抗氧化指标 （CAT，GSH，MDA，SOD 等）进行检测。

1.3.7 数据处理 采用Microsoft Excel 进行数据整理，用SPSS 20.0 和Origin 8.0 进行数据分析和作图，用t 检验进行显著性检验，试验结果以平均数±标准差（Mean±SD）表示。试验重复次数n≥3。

2 结果与分析

2.1 酶解产物基本指标分析

通过双酶和三酶酶解工艺制备的小麦蛋白酶解产物的相关指标如表1所示。

表1 小麦蛋白水解物基本指标Table 1 The basic indexes of wheat gluten hydrolysate

由表1可知，采用三酶酶解工艺所获得的AWGH 短肽含量高于PWGH。由于反应过程中需要调节体系的酸碱度以达到碱性酶较合适的pH值，从而引入了较多的盐离子，导致灰分增加，蛋白含量有所降低。同时，由于三酶酶解工艺中小麦蛋白酶解程度加深，Gln 含量有所下降。

2.2 小麦蛋白及其水解产物体外消化前、后分子质量分布

采用高效凝胶过滤色谱法检测小麦蛋白酶解物体外消化前、后的分子质量组成，并与小麦蛋白体外消化产物进行对比，结果见表2。

表2 小麦蛋白及其水解产物体外消化前、后分子质量分布Table 2 The change of molecular weight distribution of wheat protein and hydrolysatesas affected by digestion in vitro

一般而言，分子质量低于1 ku 的肽类称为低聚肽，主要含有3～6 个氨基酸。现代消化理论的观点认为，低聚肽可以被动物体消化道直接吸收利用，具有耗能低，转运速度快等特点，与游离氨基酸不存在吸收竞争效应，有效提高了蛋白质的吸收利用率[10]。小麦蛋白双酶酶解产物中低聚肽（Mw 181～1 000 u）含量占总量的60%，三酶复合酶解工艺相对于双酶酶解工艺水解程度深。而2种小麦蛋白水解物中Mw>5 000 u 的部分均低于15%。小麦蛋白直接经过体外模拟消化后的产物中低聚肽含量仅为40%，Mw > 5 000 u 的部分约占总量的20%；而2 种小麦蛋白复合酶解产物经过体外完全消化后的产物中低聚肽含量均高达80%以上，不含Mw>5 000 u 的部分。因此经小麦蛋白复合酶酶解的产物与小麦蛋白相比可能更易被人体消化吸收。

2.3 不同浓度H2O2 处理下Caco-2 细胞形态学观察

不同浓度H2O2处理Caco-2 细胞4 h 后，在光镜下观察Caco-2 细胞的形态结构，如图1所示。200～600 μmol/L 的H2O2处理后细胞的形态结构和贴壁能力与空白对照组相比无明显的变化；1 000 μmol/L 的H2O2处理后细胞开始皱缩、变圆，少量细胞皱缩成团；当1 600～2 000 μmol/L 的H2O2处理后细胞皱缩程度明显加深，甚至出现部分脱落现象，说明在此H2O2浓度处理下，细胞受到了强烈的氧化损伤。

图1 Caco-2 细胞在光镜下的形态结构（200×）Fig.1 Morphology of Caco-2 cells under light microscope （200×）

2.4 不同浓度H2O2 处理下Caco-2细胞存活率

不同浓度H2O2处理Caco-2 细胞4 h 后，采用MTT 法测定Caco-2 细胞的存活率，根据寇氏法计算得到H2O2处理Caco-2 细胞4 h 的半致死率浓度为2.07 mmol/L。因此选择浓度为2 mmol/L 的H2O2作为Caco-2 细胞氧化应激损伤模型的建立条件。

2.5 小麦蛋白水解物预处理下氧化应激损伤细胞的存活率变化

添加不同质量浓度的小麦蛋白水解物预处理细胞，用H2O2使细胞发生氧化应激损伤，测定每组细胞的存活率，结果如图2所示。添加0.5 mg/mL PWGH 预处理的细胞与模型对照组相比，细胞存活率显著提高（P<0.05），添加1 mg/mL 及以上浓度的PWGH 和AWGH 预处理的细胞存活率与模型对照组相比均有极显著提高（P<0.01），添加1 mg/mL 及以上浓度的PWGHH 和AWGHH 预处理的细胞存活率与模型对照组相比均有显著提高（P<0.05），而添加WGH 预处理的细胞存活率与模型对照组相比没有显著差异。

表3 Caco-2 细胞存活率测定结果Table 3 The results of Caco-2 cells survival rate

图2 小麦蛋白水解物对氧化损伤细胞存活率的影响Fig.2 The effects of wheat gluten hydrolysates on the survival rate of oxidative damage cell

图3 小麦蛋白水解物对氧化损伤细胞CAT 活力的影响Fig.3 The effects of wheat gluten hydrolysates on the CAT activity of oxidative damage cell

2.6 小麦蛋白预处理下氧化应激损伤细胞的抗氧化能力

2.6.1 过氧化氢酶活力 过氧化氢酶（CAT）是机体细胞内主要清除过氧化氢的酶，能使细胞免除H2O2的侵害，是生物防御体系中的关键酶之一。研究表明[11]，氧化应激损伤细胞的CAT 活力会明显下降。

添加2 mg/mL 的小麦蛋白水解物预处理细胞，用H2O2使细胞发生氧化损伤，测定每组细胞裂解液的CAT 活力，结果如图3所示。正常组（Control）细胞的CAT 活力最高，H2O2处理后细胞的CAT 活力显著下降（P<0.01），与模型对照组相比，添加PWGH 及其体外消化产物（PWGHH）和AWGH，细胞CAT 活力均显著提高（P<0.01）。添加AWGH 的体外消化产物（AWGHH）或小麦蛋白体外消化产物（WGH），细胞的CAT 活力与模型对照组相比没有显著差异。

图4 小麦蛋白水解物对氧化损伤细胞GSH 含量的影响Fig.4 The effects of wheat gluten hydrolysates on the GSH content of oxidative damage cell

2.6.2 GSH 含量 研究表明，利用H2O2使细胞发生氧化应激损伤，氧化损伤细胞内的GSH 含量将明显下降[12]。而Gln 是GSH 合成的前体物质[13]，小麦蛋白通过人体肠道后能够快速被吸收利用释放Gln，能为细胞GSH 的合成提供底物来源。每组细胞裂解液的GSH 含量如图4所示。正常组细胞的GSH 含量最高，H2O2处理后细胞的GSH 含量显著下降（P<0.01），说明细胞受到了强烈的外界刺激，加快了细胞内GSH 的消耗，抗氧化能力明显下降；与模型对照组相比，添加PWGH 及其体外消化产物PWGHH 和AWGH，GSH 含量显著提高（P<0.01），添加AWGH 消化产物的细胞，GSH 含量与模型组相比没有显著差异，而添加WGH 细胞的GSH 含量低于模型对照组（P<0.01）。

2.6.3 SOD 活力 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内一种重要的抗氧化酶，主要用来清除体内的自由基，广泛分布在各种细胞内[14]，其活力的高低受多种因素影响[15]。每组细胞裂解液的SOD 活力如图5所示。正常组细胞的SOD 活力和H2O2处理组细胞稍有差异（P<0.05），添加复合酶酶解产物（PWGH，AWGH） 及二者的体外消化产物（PWGHH、AWGHH）、WGH 的细胞SOD 活力极显著下降（P<0.01）。这与文献[16]报道相似，说明通过H2O2刺激细胞发生氧化应激损伤不会使胞内SOD 活力大幅度下降，小麦蛋白水解物也不能通过提高氧化损伤细胞的SOD 活力来提高细胞的抗氧化能力。

2.6.4 MDA 含量 丙二醛（MDA）是机体内脂质发生过氧化反应的重要产物之一，能加剧细胞的损伤，具有细胞毒性。研究表明[17]，H2O2使细胞发生氧化应激会造成脂质过氧化，从而使细胞内MDA 含量增加。因此，胞内MDA 浓度的变化可作为细胞发生氧化应激损伤的评判指标之一。每组细胞裂解液的MDA 含量如图6所示。H2O2处理后细胞的MDA 含量极显著上升（P<0.01），表明细胞内脂质发生了强烈的过氧化反应，产生了大量的MDA，细胞发生了严重的氧化损伤；与模型对照组相比，添加PWGH 和AWGH 及其体外消化产物和小麦蛋白体外消化产物预处理细胞的MDA 含量均有明显下降（P<0.01），表明5 种样品均能在一定程度上缓解氧化应激损伤细胞的脂质氧化现象，减少细胞损伤程度。

图5 小麦蛋白水解物对氧化损伤细胞SOD 活力的影响Fig.5 The effects of wheat gluten hydrolysates on the SOD activity of oxidative damage cell

图6 小麦蛋白水解物对氧化损伤细胞MDA 含量的影响Fig.6 The effects of wheat gluten hydrolysates on the MDA content of oxidative damage cell

3 结论

本研究采用双酶和三酶对小麦蛋白进行复合酶水解后，其体外模拟消化产物均能在一定程度上缓解肠上皮细胞因氧化应激损伤导致的存活率降低，减少细胞发生氧化应激的损伤程度，且能在一定程度上缓解细胞因H2O2过量导致的氧化应激损伤和抗氧化能力降低。研究表明，水解产物经模拟消化后其抗氧化功能受到酶制剂种类的影响。小麦蛋白直接经体外模拟消化后，其水解产物虽能在一定程度上减少肠上皮细胞损伤细胞的脂质氧化，但对损伤细胞的抗氧化能力和GSH 水平均无显著影响。