张丽亚，贾培君，尚晋文，张成娟

(郑州大学附属肿瘤医院、河南省肿瘤医院生物样本中心，河南 郑州 450008)

食管癌是恶性程度较高的消化系统肿瘤之一,分为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinomas,ESCC)与食管腺癌,2018年全球癌症数据最新统计显示,全球食管癌新发病例约为57.2万例,在36种恶性肿瘤中占3.2%,排第7位，死亡病例约为50.8万例,占5.3%,排第6位[1]。我国亦是食管癌的高发地区，2015年的研究分析显示，食管癌的发病率占全部恶性肿瘤的第6位，死亡率占第4位[2]。早期食管癌症状不明显，且无特异性诊断方法,因此，大部分患者确诊时已属中晚期，根治性治疗手段有限，临床上预后较差[3]。

肿瘤标志物是指存在于特定的恶性肿瘤细胞,或由恶性肿瘤细胞产生,或肿瘤对宿主的刺激产生,并能反映肿瘤发生、发展和监测肿瘤对治疗反应的一类物质。临床上寻找有效的肿瘤标志物,对食管癌患者提高生存率降低死亡率等具有十分重要的意义。本文就近年来报道的食管癌肿瘤标志物进行总结，分别从DNA、RNA和蛋白质等方面进行阐述。

1 DNA类肿瘤标志物

1.1 DNA甲基化DNA甲基化是一种常见表观遗传过程，在不影响基因组DNA序列本身的情况下，通过DNA甲基化转移酶的作用在含胞嘧啶、鸟嘌呤的二核苷酸的胞嘧啶上添加一个甲基基团，可导致基因表达的抑制[3]。DNA甲基化在恶性肿瘤发生、发展的各个阶段都发挥着重要的作用，单个或多个基因的甲基化可作为分子生物标志物，用于恶性肿瘤的分类、早期诊断、治疗监测以及复发转移的预测。

Tang等[4]通过焦磷酸测序法发现ESCC肿瘤组织中成对盒基因1(paired box gene 1,PAX1)、性别决定区域Y-box-1(sex determining region Y-box-1,SOX1)和锌指蛋白582(zinc finger protein582,ZNF582)的DNA甲基化水平均高于配对的癌旁组织和正常组织，提示检测PAX1、SOX1、ZNF582基因的甲基化状态可能是一种有前途的ESCC筛查和诊断的生物标志物。Kurimoto等[5]对78例经手术切除的ESCC患者采用定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR,qMSP)评价PAX5的甲基化状态，结果显示ESCC肿瘤组织平均qMSP值较邻近正常组织高，高qMSP值者无复发生存率较低，并且PAX5敲除细胞的增殖和对顺铂的耐药性明显增加，提示PAX5基因甲基化预示ESCC患者较差的生存结局和顺铂敏感性，可作为恶性肿瘤治疗方案选择的有效辅助工具。Chen等[6]采用MSP检测135例ESCC组织中性多聚甲醛固定石蜡包埋组织的转录因子叉头框F2(Forkhead box F2,FOXF2)启动子甲基化状态，结果发现FOXF2启动子甲基化可以独立预测ESCC患者的总体生存率，提示FOXF2启动子甲基化可能是一种有用的ESCC患者预后的生物标志物。

1.2 融合基因融合基因是由2个先前独立的亲本基因形成的杂交基因。以往，基因融合被视为恶性肿瘤中常见的驱动突变，与血液、淋巴和骨髓组织有关，但在实体肿瘤中也扮演着越来越重要的角色，并且可以作为诊断和治疗的分子靶点。Jiang等[7]通过全转录组测序在ESCC中发现了一种新的融合基因人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-E和HLA-B，这将成为ESCC诊断的生物标志物和治疗靶点，为更好了解ESCC的肿瘤发生机制提供新的思路。Blum等[8]通过综合RNA测序评估了55例预治疗食管腺癌和49例巴雷特食管内镜检查患者的非恶性活检组织的基因融合情况，发现21个新的候选食管腺癌相关融合基因，选择2个候选融合体进行PCR和Sanger测序验证，观察到核糖体蛋白S6激酶β1(RPS6KB1)-泡膜蛋白1(vacuole membrane protein 1，VMP1)基因融合在大约10%的食管腺癌病例中反复发生，并且RPS6KB1-VMP1融合的食管腺癌患者总体生存期明显较差。RPS6KB1-VMP1是一种通过调节自噬相关过程促进食管腺癌的基因融合，为其分子发病机制提供了新的见解。

1.3 单核苷酸多态性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为第3代遗传标记，具有分布广泛、数量多、遗传特性稳定和易于快速、规模化筛查的特点，既是阐明肿瘤易感性的分子基础，揭示肿瘤异质性的根本原因，也可作为鉴别易感人群和靶向治疗的分子标志[9]。Vashist等[10]从190例单纯行食管癌全切除的患者外周血白细胞中提取基因组DNA并分析临床数据，发现T393C-SNP是食管癌患者复发和生存的一个强有力的独立预后因素。因此，T393C GNAS1多态性作为食管癌独立预后标志物，术前确定GNAS1基因型可将患者分为不同的风险状况，并可能有助于定制治疗和随访方案。Yang等[11]对中国宁夏地区80例恶性肿瘤患者和200例非恶性肿瘤对照采用PCR直接测序法鉴定了p21Waf1/Cip1基因3种变异(codon31、IVS2+16、SNP309)，并分析了3种SNP的单倍型和单个SNP与食管癌的关系，发现密码子31Ser等位基因纯合性，无论是单独或与其他2个SNP结合，可能与食管癌的发展有关。见表1。

表1 DNA类肿瘤标志物

2 RNA类肿瘤标志物

2.1 长链非编码RNA长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是长度大于200个核苷酸的不能翻译成蛋白的功能性RNA,参与基因组印记、转录激活、转录干扰、核内运输等多种调控过程。许多lncRNA在多种恶性肿瘤组织中表达失调，在肿瘤发生和肿瘤进展中发挥重要作用,可作为一种新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点。

一个典型例子就是由HOXC位点表达的同源异型盒基因转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)。Lv等[12]通过原位杂交和定量逆转录酶PCR(quantitative reverse transcriptase PCR,qRT-PCR)检测HOTAIR的表达差异，发现ESCC组织中HOTAIR表达明显增高，HOTAIR在ESCC患者中的高表达水平与临床分期、TNM分级、组织学分化程度呈正相关。因此，HOTAIR是ESCC预后的一种潜在的肿瘤标志物，其失调可能在ESCC进展中起重要作用。Bao等[13]采用qRT-PCR检测147例ESCC患者发现ESCC组织中FOXD2相邻的反链RNA1(FOXD2-AS1)表达高于邻近非肿瘤组织，而且Kaplan-Meier分析结果显示，ESCC患者中FOXD2-AS1高表达与预后不良相关。因此，FOXD2-AS1可能作为ESCC患者判断预后的肿瘤标志物。

2.2 嵌合RNA嵌合RNA由2个或2个以上基因的外显子组成，并具有编码新蛋白改变细胞表型的潜力。嵌合RNA不仅可以在DNA水平上通过染色体重排产生，还可以在RNA水平上通过基因间剪接产生。嵌合RNA可以发挥新的细胞复杂性能，与恶性肿瘤发生、发展存在着密切关系，可作为肿瘤诊断和预后的生物标志物。

Zhang等[14]分析了32个复发性恶性肿瘤嵌合RNA在ESCC及其细胞株中的表达情况，发现GOLM1-MAK10是ESCC中的一种恶性肿瘤富集嵌合RNA，而且原位杂交显示，嵌合体的表达主要局限于患者的肿瘤细胞，在正常受试者的非肿瘤性食管组织中几乎检测不到。总的来说，这些发现为ESCC的分子机制研究提供了新的思路，并为食管癌未来的治疗提供了新的潜在靶点。Lin等[15]使用qRT-PCR检测唾液外泌体GOLM1-NAA35嵌合RNA，并分析其诊断准确性、治疗反应的纵向监测和无进展生存期的预测，结果显示体外GOLM1-NAA35嵌合RNA在ESCC细胞和裸鼠ESCC异种移植中均可检测到，GOLM1-NAA35嵌合RNA水平反映体内肿瘤负荷。因此，唾液外泌体GOLM1-NAA35嵌合RNA是一种有效的非侵入性生物标志物，可方便、可靠地评估治疗反应、复发和早期检测。

2.3 微小RNA微小RNA(microRNA,miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其参与转录后基因表达的调控。MiRNA表达的改变也会改变癌基因和抑癌因子的表达，影响了包括ESCC在内的胃肠道肿瘤细胞的增殖、凋亡、能动性和侵袭性[16]。多种miRNA表达谱可能提供有用的生物标志物和治疗靶点。

Wang等[17]通过qRT-PCR检测新鲜ESCC组织中miR-3651的表达水平,统计并分析miR-3651表达与临床特征和预后的关系，结果显示，肿瘤组织中miR-3651的表达较癌旁组织明显下调，miR-3651的表达与ESCC的肿瘤浸润程度呈负相关。MiR-3651可能在恶性肿瘤进展中发挥重要作用，并可作为ESCC患者的预后标志物。Jiang等[18]的研究结果显示食管癌患者血清中miR-218的表达明显低于健康人,分化较差、晚期、淋巴结转移的患者血清中miR-218的表达更低，因此，血清miR-218可能是食管癌患者早期检测和临床评价的潜在生物标志物。Kurashige等[19]采用RT-PCR检测71例ESCC患者和39例健康对照者血清miR-21水平后发现，ESCC患者血清miR-21明显高于健康对照者，术后样本与术前样本相比，血清miR-21水平显著降低。此外，miR-21水平在对化疗有反应的ESCC患者中显著降低(P=0.003)，而在无反应的ESCC患者中无显著变化。因此，血清miR-21被认为是诊断ESCC的一种新的生物标志物，也可以作为ESCC患者化疗期间的反应标志物。见表2。

表2 RNA类肿瘤标志物

3 蛋白质类肿瘤标志物

Numb蛋白在细胞分裂过程中的不对称分离决定了细胞的结局,其具有多种功能，涉及发育神经生物学和肿瘤生物学等多个研究领域。Liu等[20]通过对212例患者的组织芯片分析发现,与对应的非肿瘤组织相比,ESCC组织中的Numb蛋白明显上调。Kaplan-Meier生存分析提示,高表达的Numb蛋白与高肿瘤复发率(P=0.015)和低整体术后生存(P=0.016)显著相关。因此，Numb蛋白有潜力作为一种新的预后标志物和治疗靶点。

CD59是一种膜结合的补体调节蛋白，可以通过脂质筏上的Src激酶传递信号，从而发挥与补体无关的作用。Zhou等[21]发现CD59的表达水平与食管癌细胞系和临床标本的耐辐射性呈正相关。在接受放疗的ESCC患者中高表达的CD59提示较差的总生存率和无病生存率。CD59表达的遗传改变调节了食管癌细胞对电离辐射的敏感性。因此，CD59可能是预测ESCC对放疗的敏感性的潜在生物标记。

血管生成素样蛋白2(angiopoietin-like protein,ANGPTL2)介导慢性炎症，肿瘤细胞来源的ANGPTL2促进肿瘤侵袭和血管生成。ANGPTL2在肿瘤细胞中的过表达与肿瘤的进展有关，在肺癌、乳腺癌、结肠癌和胃癌中均有发现。Ide等[22]研究发现ANGPTL2低表达降低了食管癌细胞系的增殖、侵袭和迁移能力，高分化的ESCC组织中ANGPTL2表达明显升高，ANGPTL2高表达患者的总生存率和无病生存率明显低于低表达患者。因此，ANGPTL2可作为食管癌诊断和预后的一种新的生物标志物。

自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。抗肿瘤相关抗原的自身抗体已在多种恶性肿瘤中发现，并可作为早期恶性肿瘤诊断的生物标志物。Chen等[23]收集149例ESCC患者和98例健康对照者，通过酶联免疫吸附试验测定发现早期ESCC患者血清中针对成束蛋白的自身抗体水平明显高于正常对照组(P<0.05)。这提示成束蛋白自身抗体可能是一种潜在的ESCC早期检测的生物标志物。Ye等[24]的研究发现叉状头/翅膀状螺旋转录因子(forkhead/winged helix transcription factor,FOXP3)循环IgG自身抗体可能是早期诊断食管癌的潜在生物标志物。某些自身抗体联合检测，可以在获得较高水平的特异性的同时获得更高的敏感性[25]。见表3。

表3 蛋白质类肿瘤标志物

4 结语

肿瘤标志物对食管癌患者的诊断治疗和判断预后有一定的帮助，但是许多标志物仍处于实验探索阶段，具有一定的局限性，缺乏高敏感性和特异性，有些检测方法繁琐且昂贵不适合于临床大规模应用。另外，部分研究样本量较小，结果说服力不强。然而肿瘤标志物在早期诊断中简单易行且相对无创的优点还是十分明确的。相信未来随着检测技术的不断发展，肿瘤标志物敏感性和特异性均会得到提高，其将会成为越来越重要的辅助检测手段，而且多个肿瘤标志物的联合检测可以提高敏感性和特异性，更好为食管癌患者的诊断治疗和判断预后提供指导意义。