洪建明，占景华，蔡明勇

(福建医科大学附属漳州市医院普通外科，福建 漳州 363000)

胃癌居全球恶性肿瘤相关死亡原因第2位，占全部恶性肿瘤死亡的10.4%[1]，在我国其发病率也呈上升趋势。近年来，免疫治疗作为一种通过激活机体免疫系统来特异性清除肿瘤细胞的新方法正逐步应用到胃癌的治疗中。肿瘤研究领域的学者越来越多把目光集中在免疫治疗上，但是如今的免疫治疗也存在诸多问题[2]。生存素作为凋亡蛋白家族抑制剂的成员之一，在人类许多种恶性肿瘤中过表达，阳性表达的生存素与分化相关，通过核糖核酸干扰后可导致胃癌细胞增殖和迁移降低[3]。更进一步研究发现，生存素导致细胞周期静止，这表明生存素在胃癌中起重要作用，并且使用生存素沉默核糖核酸可能成为恶性肿瘤治疗的有效方法[4]。至今，已有很多学者利用生存素及其异构体的表位作为基础载体研究出不同的基因疫苗或肽疫苗，并在抗肿瘤中取得成果，故我们通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法将胃泌素抗原表位-生存素抗原表位基因及类热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)蛋白基因连接在原核表达载体中，经异丙基硫代半乳糖苷诱导表达胃泌素-生存素-热休克蛋白(Gas-Sur-Hsp70L1)融合蛋白。我们通过Western Blot法鉴定Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的性质，应用体外的细胞实验和体内的动物实验了解Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的免疫激活活性以及对小鼠体内肿瘤细胞生长的影响。

1 资料与方法

1.1 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白和相关对照蛋白的原核表达与纯化从高胃泌素血症患者胃窦组织样品中克隆胃泌素互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)全长，以此为模板PCR扩增编码前胃液素第1～14位氨基酸残基组成的编码片段；从胃癌患者胃组织样品中克隆生存素cDNA全长，以此为模板PCR扩增编码生存素第32～54位氨基酸残基组成的编码片段；从健康志愿者外周血细胞培养的树突状细胞中克隆HSP cDNA全长。

通过酶切连接构建pET28a-Hsp70L1、pET28a-Gas1-14-Hsp70L1、pET28a-Sur32-54-Hsp70L1、pET28a-Gas1-14-Sur32-54-Hsp70L1质粒。重组表达质粒分别转化大肠杆菌BL21，在LB培养基中用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，Western Blot法检测表达蛋白；表达蛋白的N端均带有6×His标签，包涵体蛋白通过变性、复性；依次用Ni+金属离子鳌合层析、离子交换层析进行纯化，纯化产物透析至磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)中冻存待用；银染SDS-PAGE分析融合蛋白纯度；鲎试剂测定法分析细菌脂多糖污染。

1.2 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白对树突状细胞成熟的促进作用研究将培养第7天的小鼠非成熟树突状细胞，经10 μg/mL Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白作用48 h后，流式细胞仪检测树突状细胞表型：树突状细胞表面CD40、CD80、CD86、Iab等表面分子的表达情况。

1.3 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在小鼠体内抗肿瘤活性研究在C57BL/6小鼠近尾根部右侧背下部皮下肌注胃癌细胞，接种成功标准为注射局部出现直径7 mm左右的皮丘。实验分组：将50只带瘤小鼠随机均分为5组，每组10只小鼠。1)空白对照组：接种肿瘤后不予任何处理；2)阴性对照组：第1、4、7、14天在小鼠后腿部近淋巴结处皮下注射200 μL的PBS；3)1 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白组：第1、4、7、14天于小鼠后腿部靠近淋巴结处皮下注射200 μL的5 g/L Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白；4) 10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白组：第1、4、7、14天于小鼠后腿部靠近淋巴结处皮下注射Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白200 μL的50 g/L Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白；5) 100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白组：第1、4、7、14天于小鼠后腿部靠近淋巴结处皮下注射Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白200 μL的500 g/L Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白，给药后每3 d测量肿瘤体积。肿瘤体积按公式V=1/2ab2(a=瘤长，b=瘤宽)计算。

2 结果

2.1 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的鉴定Western Blot结果显示本实验所得Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白与抗生存素单克隆抗体结合。生存素的特异性在Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白中同样存在。

2.2 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白对人树突状细胞表面CD86表达的影响流式细胞术检测提示通过引入Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白后我们观察到树突状细胞表面CD86分子得到明显表达，表达上调达到52.93%，这与对照细胞明显不同，说明该融合蛋白能促进树突状细胞的活化成熟与表达。结果还显示，融合蛋白中的脂多糖杂质也可以促进CD86分子的表达，表达上调率为27.77%。上述对比提示Gas-Sur-Hsp70L1蛋白对CD86分子的上调起主要作用，前者比后者多38.60%。

2.3 Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在小鼠体内的抗肿瘤活性阴性对照组、空白对照组、1 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白组、10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白组、100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白组肿瘤体积分别为(12.67±6.31)、(14.39±6.47)、(12.16±4.81)、(4.94±5.51)、(6.64±3.81)cm3。10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白组、100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白组肿瘤体积均高于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)。1、10、100 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白均可以抑制小鼠体内肿瘤生长，抑制率分别为0.04%、61.01%、47.59%。从实验结果可以看出10 μg Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白具有最明显有效抑制小鼠体内肿瘤生长的作用。

3 讨论

在众多实验中外源性肿瘤抗原通常只能通过体内免疫诱导体液免疫反应，然而细胞免疫反应在肿瘤免疫中起主要作用[5-6]。因此，大多数肿瘤免疫领域的学者致力于寻找探索一种有效的方法或介质可以把外源性肿瘤抗原或肽疫苗引入到细胞免疫途径中。许多研究[7]表明，外源性主要组织相容性复合体-I(major histocompatibility complex-I，MHC-I)类肿瘤抗原表位可以通过HSP将其引导入细胞免疫中并发挥作用，激活细胞毒性T淋巴细胞攻击、杀灭相应的肿瘤细胞。本实验中连接HSP70L1和生存素的部分MHC-I类抗原表位制成融合蛋白，进而诱导机体进行抗肿瘤免疫作用。

本实验我们通过从人的浓缩白细胞中提取未成熟的树突状细胞，并在体外用Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白作用于此树突状细胞,通过检测树突状细胞表面分子CD86的表达情况发现，Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在促进树突状细胞表面分子CD86的表达方面起主要作用。这提示Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白对于树突状细胞的成熟起着促进作用，从而起着抗肿瘤免疫的作用。负载不同剂量Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的树突状细胞注射荷瘤小鼠后，结果发现，剂量为10 μg的Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白对小鼠的肿瘤生长的抑制作用最明显。这提示并不是Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白剂量越大抑瘤效果越好，最佳抑制肿瘤生长的剂量还需进一步研究。

如今肿瘤抗原的选择是抗肿瘤免疫研究的热点之一，将外源性肿瘤抗原引入细胞免疫途径成为关键步骤[8]。本实验设计并合成了一种Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白，发现其可以促进树突状细胞活化、成熟等。我们还发现Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白在小鼠体内产生了特异性的抗肿瘤作用，目前已经有研究证实Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白用于肿瘤的免疫治疗是可行的[9]。我们也初步发现并证明了Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白的免疫激活作用和抗肿瘤作用[10-12]。总之，Gas-Sur-Hsp70L1融合蛋白可能具有一定的抗肿瘤活性。