杨舒婷 欧静 李林盼 何跃军

摘要：[目的]探索杜鹃苗对不同混合接菌组合及营养元素的生理响应机制。[方法]以2年生杜鹃（Rhododendronslmsil）苗为研究对象，采用J1（杜鹃花类菌根真菌混合接菌）、J2（杜鹃花类菌根真菌和马尾松外生菌混合接菌）、J3（不接菌，对照）3种接菌组合与不同氮磷钾施肥水平，研究菌根真菌与氮磷钾肥对杜鹃苗生理生化特性的影响，测定杜鹃幼苗生物量、叶绿素含量（chl）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白（SP）含量、可溶性糖（SS）含量、生长素（IAA）含量、细胞分裂素（ZR）含量、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）含量的变化情况，并采用主成分分析法对各指标进行筛选。[结果]混合接菌和施肥处理都能提高杜鹃叶片的叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、SP含量、IAA含量、ZR含量和GA₃含量，降低杜鹃幼苗的MDA含量，同时接菌处理较不接菌处理只需要施正常氮磷钾肥量的1/4-1/2水平即可最大程度增强杜鹃苗的生理水平，特别是接J2处理。菌根共生体可能是通过促进养分吸收，增强光合作用能力，刺激激素合成，降低膜脂过氧化程度，提高保护酶活性，增强杜鹃苗的抗逆能力，促进杜鹃苗生长。根据相关性分析可得，各指标均具有相关性。[结论]生理生化指标总体表现为接菌处理优于不接菌处理，J2处理施养分1/2水平（即施用尿素1.1g·株^-1、钙镁磷1g·株^-1、氯化钾0.7g·株^-1）对杜鹃苗生长及生理生化指标的影响最为明显，叶绿素含量（Chl）、超氧化物歧化酶活性（SOD）、可溶性蛋白（SP）、生长素（IAA）、赤霉素（GA₃）可以作为反映杜鹃苗生长评价的主要指标。

关键词：菌根真菌;混合接菌;营养元素;杜鹃;生理生化特性

中图分类号：S685.21文獻标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）05-0509-10

0 引言

（研究意义）贵州多为喀斯特地貌，山林土壤养分含量极低，土壤较为贫瘠，施肥能够促进植株生长，但长期的施肥试验发现，养分过高或过低对植株生长都不利，且长期施用化肥，不仅成本过高，还破坏土壤结构，造成土壤板结，污染水源等不良后果。菌根真菌是土壤微生物群落的重要组成部分，能与大部分植物形成共生的菌根结构，植物可以依靠菌根菌来缓解环境压力，吸收矿质元素及养件，促进植物的生长，接种菌根真菌与施用化肥相结合，不仅有利于改善土壤板结，而且能够提高土壤供水、保肥能力。杜鹃（Rhododendron simsiiPlanch.）为杜鹃花科Ericaceae杜鹃属Rhododendron落叶灌木，主要分布在我国西南山区，杜鹃花科大多数植物能与杜鹃花类菌根真菌（Ericoid mycorrhiza，ERM）形成菌根共生体。马尾松（Pinus massonianaLamb.）为松科Pinaceae松属Pinus乔木，能与外生菌根真菌（Ectomycorrhiza，ECM）形成外生菌根共生体。杜鹃与马尾松均喜酸性土，且在贵州山林中杜鹃常以马尾松的伴生树种存在，探究其适宜共生的真菌群落及适宜生长的养分浓度，能够提高马尾松林下生态效益。（前人研究进展）近年来，利用植物一微生物共生系统开发植物资源引起了广泛关注，本课题组前期研究发现，桃叶杜鹃接种ERM菌根真菌能促进植株生长;前人研究认为，马尾松与菌根真菌共生在干旱调节下可以促进马尾松苗木的生长，彩色豆马勃（PisoBthus tinctorius）和美味牛肝菌（Boletus edulis）混合接种马尾松，能明显促进马尾松幼苗生长，说明仿自然真菌群落研究较单一接菌具有更强的现实意义;熊丹研究发现，马尾松与杜鹃花可以通过地下菌根群落进行交流。（本研究切入点）研究混合接种的接种效应，不仅有利于进一步筛选适宜的菌根真菌，亦有助于解释植株对立地的适应性，然而，马尾松外生菌根与杜鹃花类菌根对杜鹃促生作用的对比研究还较为欠缺，关于利用杜鹃花类菌根真菌与马尾松外生菌根真菌共同作用减少化肥施用的研究也较少。因此，本试验借鉴自然菌根群落共生机制，探讨混合接种对宿主养分吸收和利用的影响，采用不同混合接菌组合及不同N、P、K施肥组合对杜鹃幼苗进行处理，研究接种ERM和ECM+ERM在不同养分梯度下的生理生化响应，对指标进行分析后利用主成分分析法筛选出评价影响其生长的主要指标。（拟解决的关键问题）筛选出适宜杜鹃生长的菌根真菌组合和接菌后最适施肥浓度，为杜鹃苗栽培提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试菌株 供试的4个菌株MG27、LLl6、LL03、MGl7为前期分离自贵州省贵阳市孟关镇及龙里市的马尾松林下杜鹃花根系，是杜鹃花内生菌在内的丰度较高的内生真菌，所选供试菌株类型具体是锤舌菌纲（Leotiomycetes）、子囊菌门（Ascomycota，2种）、担子菌纲（Basidiomycota），由课题组分离保存，采用PDA液体培养基对试验菌株进行培养，置于28℃摇床上振荡（160r·min^-1）暗培养15d，打碎并制成液体菌剂备用。供试的外生菌菌株为市场购买的美味牛肝菌Boletus edulis.

1.1.2参试植物2年无菌杜鹃苗，种植于花盆中，土壤基质为黄壤土，土壤背景值为有机质27.38g·kg^-1，全氮1.10g·kg^-1，全磷0.3l g·kg^-1，全钾9.33g·kg^-1，有效氮33.67mg·kg^-1，有效磷2.48mg·kg^-1，有效钾120.90mg·kg^-1，pH 5.39.种植基质土在种植前先风干，后利用高温高压法（121℃，0.1MPa）灭菌120min备用。

1.2 试验设计

1.2.1 接菌设计3个接菌组合，分别为Jl处理（ERM菌株混合接种）、J2处理（ECM+ERM菌株混合接种）和对照J3处理（等量不接菌的土豆培养液）。接菌采用了蘸根法与注射法，分3次进行，每次间隔10d，每盆施用10mL菌液。

1.2.2施肥设计 N肥主要成分为CO（NH₂）₂，有效N含量46.20%;P肥主要成分为P₂O₅，有效P含量为16.00%;K肥主要成分为K₂O，有效K含量为51.00%。试验分别对杜鹃苗施加。正常水平、1/4正常水平、1/2正常水平、1正常水平4个梯度的N、P、K肥料，具体方案如下（表1）。

1.2.3试验方法 每个接菌处理下都进行施肥处理，试验共30（10×3）个处理，每个处理3盆，重复3次，共270盆。2018年5月正式开始试验，试验中进行日常浇水，除草等管理，2019年1月5～6日进行数据采集。

1.2.4项目测定侵染率采用醋酸墨水染色法，生物量稱取鲜重和干重;叶绿素含量测定采用浸泡法;可溶糖含量测定采用蒽酮比色法;可溶蛋白测定采用考马斯亮蓝法;MDA含量（nmol·g^-1）采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定;超氧化物歧化酶（SOD）活性（U·g^-1）采用可见分光光度法测定;过氧化氢酶（CAT）活性（U·g^-1）采用紫外分光光度法测定;过氧化物酶（POD）活性（U·g^-1）采用可见分光光度法测定，以上测试方法均参考蔡永萍《植物生理学实验指导》。杜鹃内源激素采用酶联免疫吸附检测法（ELISA）进行测定，取样完成后送中国农业大学进行统一测定。

1.2.5数据处理利用SSPS24.0软件进行单因素分析比较Jl、J2、J3之间的几个处理间的差异性，采用Duncan法进行多重比较，Origin 8.0软件进行作图与参数分析。

2 结果与分析

2.1 不同接菌组合杜鹃苗菌根侵染率

取样前对根系用醋酸墨水染色法进行侵染率测定，试验发现2组接菌组合杜鹃苗均被成功侵染，两组菌株的侵染率存在差异（P<0.05），其中ECM+ERM菌株混合接种（J2）处理侵染率最高，比ERM菌株混合接种（J1）高6.99%，未接种的CK处理（J3）幼苗根系侵染率为8.85%，极显著低于接种处理幼苗根系的侵染率（表2）。

2.2 混合接菌及营养元素对杜鹃苗生物量的影响

如表3所示，接菌和施肥对杜鹃苗的茎粗、根冠和鲜重影响显著（P<0.05）;接菌处理的茎粗随施肥均呈现先增加后降低趋势，在N、P、K的1/2水平茎粗增幅最大，对照J3处理有增加趋势，也有先增加后降低趋势，在1/2及l水平茎粗增幅最大;各接菌处理的根冠增幅均随N、P肥施加呈增加趋势，在1水平增幅最大，接菌处理随K肥施加出现先增加后降低趋势，Jl和J2分别在1水平和1/2水平增幅最大，对照在1水平最大;J2和对照的鲜重呈增加趋势，均在1水平最大，Jl随N、K肥施加呈先增加后降低趋势，在1/2水平最大，在P肥的l水平最大。不同接菌处理的茎粗、根冠和鲜重大小整体均呈现J2>J1>J3.

2.3 混合接菌及营养元素对杜鹃苗叶绿素含量的影响

如表4所示，除叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素总含量的J3在K肥各处理下差异无统计学意义外，接菌和施肥对杜鹃苗的叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素总含量影响显著（P<0.05）;接菌处理的叶绿素a含量随P、K肥的施加呈先增加后降低趋势，均在1/2水平最大，接菌处理随N肥的施加与对照处理随N、P、K的施加均呈增加趋势，在l水平最大;接菌处理的叶绿素b含量和叶绿素总含量除了Jl随N肥增加而增加外，其余处理均呈先增加后降低趋势，在1/2水平最大，对照处理呈增加趋势，均在l水平最大。不同接菌处理的叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素总含量大小整体均呈现J2>J1>J3.

2.4 混合接菌及营养元素对杜鹃苗氧化酶活性的影响

如表5所示，除POD活性各接菌处理在K肥各处理下差异无统计学意义外，接菌和施肥对杜鹃苗的SOD、POD、CAT活性影响显著（P<0.05）;接菌处理的SOD、POD、CAT活性随施N、P、K肥均呈现先增加后降低趋势，Jl处理除POD活性在N处理的l水平处最高外，其余处理均在1/2水平处含量最高，J2处理均在1/4处含量最高，对照处理的SOD、POD、CAT活性施N、P、K肥施加呈增加趋势，均在l水平处含量最高。不同接菌处理的SOD、POD、CAT活性大小整体均呈现J2>J1>J3.

2.5 混合接菌及营养元素对杜鹃苗丙二醛及渗透条件物质的影响

如表6所示，接菌和施肥对杜鹃苗的丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖含量影响显著（P<0.05）;丙二醛中，儿处理随施N、P肥和J2处理随P肥有先升高后降低再升高趋势，在l水平最大，接菌处理的其他施肥处理及对照处理呈降低趋势，在0水平最大;可溶性蛋白中，接菌处理随P肥施加呈先降低再升高再降低趋势，接菌处理的其他施肥处理呈先升高后降低趋势，接菌处理在1/2水平可溶性蛋白含量最高，对照处理呈增加趋势，在l水平含量最高;可溶性糖中，接菌处理呈先降低再升高、先升高再降低后升高两种趋势，最高水平出现在l水平和1/4水平居多，对照处理呈升高趋势，在l水平含量最高。不同接菌处理的丙二醛、可溶性糖整体呈现J3高于Jl和J2，可溶性蛋白整体呈现J2>Jl>J3.

2.6 混合接菌及营养元素对杜鹃苗内源激素含量的影响

如表7所示，J3处理的ZA在N、P肥及IAA在P、K肥，Jl处理的IAA在N、P、K下差异无统计学意义外，接菌和施肥对杜鹃苗的ZR、IAA、GA₃、ABA含量影响显著（P<0.05）;接菌处理的ZR、IAA、GA₃含量呈先增加后降低趋势，Jl处理的ZR、IAA、GA₃含量在1/2水平最高，J2处理除IAA和GA₃在K肥处理中，在1/2水平最高外，其余处理均在1/4水平最高，对照处理呈增加趋势，除GA₃含量在1/2水平最高外，其余处理均在l水平含量最高;接菌处理的ABA呈先降低后增加趋势，对照处理呈降低趋势，各接菌处理均在0水平含量最高。不同接菌处理的ZR、IAA、GA₃、ABA含量大小整体均呈现J2>J1>J3.

2.7杜鹃幼苗生理指标相关性分析

本研究对杜鹃幼苗生理指标的相关性进行了分析（表8），叶绿素与超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、蛋白质含量、IAA含量、ZR含量、GA3含量显著正相关，与MDA含量显著负相关;超氧化物歧化酶与过氧化物酶、过氧化氢酶、蛋白质含量、IAA含量、ZR含量、GA₃含量显著正相关，与MDA含量显著负相关;过氧化物酶与过氧化氢酶、蛋白质含量、IAA含量、ZR含量、GA₃含量显著正相关，与MDA含量显著负相关;过氧化氢酶与蛋白质含量、IAA含量、ZR含量、GA₃含量显著正相关，与MDA含量显著负相关;MDA含量与蛋白质含量、IAA含量、ZR含量、GA₃含量显著负相关;蛋白质含量与IAA含量、ZR含量、GA₃含量显著正相关;可溶性糖含量与ABA含量显著负相关;IAA含量与ZR含量、GA₃含量顯著正相关;ZR与GA₃含量显著正相关，其余各项指标相关性不显著。

2.8 杜鹃幼苗生理指标主成分分析

本研究对杜鹃幼苗生理指标的成分特征值分布和积累情况进行了分析（表9），11个成分特征值分别为6.853、1.648、0.771、0.562、0.449、0.286、0.180、0.088、0.080、0.055和0.028，其中前2个成分的特征值均大于1，累积贡献率为77.280%，可用于杜鹃幼苗生理指标的主成分分析;后9个特征值小于l，不可以用于杜鹃苗生理指标的主成分分析。

本研究进一步对杜鹃幼苗生理指标的主成分得分系数进行了分析（表10），主成分l的特征向量中因子较高的是叶绿素、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、蛋白质含量、IAA含量、ZR含量、GA₃含量，主成分2的特征向量中因子较高的是叶绿素、超氧化物歧化酶、丙二醛含量、蛋白质含量、IAA含量、ZR含量、ABA含量。

同时本研究对杜鹃幼苗生理指标的主成分构建了排序示意图（图1），除MDA、ABA、SS、CAT、ZR、POD位于负象限内以外，其余5个生理指标均位于正象限以内。综合以上结果，主成分1中的叶绿素、超氧化物歧化酶、蛋白质含量、IAA含量、GA₃含量可以作为反映杜鹃苗生长的主要指标。

3 讨论与结论

有研究表明，菌根真菌能够促进杜鹃苗生长，本试验中混合接菌处理的茎粗、根冠及鲜重生物量显著高于对照，这与前人的研究结果一致，且接菌处理在少量养分下促生效果明显，说明混合接菌能促进杜鹃对养分的吸收利用，能有效减少人为施肥量。

叶绿素含量是衡量植株叶片光合能力的重要指标，试验中杜鹃苗的叶绿素a、b、（a+b）在接菌组高于对照，且接菌组较对照需要更少的养分即可获得更大的叶绿素含量，说明杜鹃在菌根效应及养分施加下，可以促进叶绿素的积累，进而增强叶片光合作用，从而促进植株生长，接菌处理所需养分较少可能是由于菌根效应促进植物吸收养分，提高叶绿素含量。

当植物遭受逆境胁迫时，可能导致破坏植物的抗氧化系统，促进大量的MDA积累，试验中杜鹃苗接菌组MDA含量低于对照，MDA积累量随着施肥量增加呈降低趋势，原因可能是植株生长受到一定程度的外界胁迫，如养分匮乏、天气变化等，而菌根真菌与宿主植物互惠共生，一定程度上降低了环境带来的不适应，促进养分吸收，提高植物组织各方面的机能。

SOD、POD、CAT是植物体内的重要保护酶，是植物抗逆性的重要指标，试验中接菌处理SOD、CAT、POD活性也均有不同程度的提高，说明植物在逆境条件下调控应急响应，造成SOD、CAT、POD酶的积累，可能是接种菌根真菌可以分泌类似几丁质之类的激发子，激活促分裂原活化蛋白激酶MPK6的活性，增加植物细胞抗氧化酶活性。

蛋白质是生物体内主要信号转导和生化途径的执行者，试验中，随着养分的增加施入，可溶性蛋白含量为接菌处理蛋白质含量最高，这与前人研究结果一致，且在少量养分下可溶性蛋白含量提高明显，说明接菌和少量施肥共同作用于杜鹃可以提高杜鹃可溶性蛋白含量，进而促进植株代谢水平提高，促进植株生长。

有研究表明，接菌和施肥均能提高植株可溶性糖含量，本试验中，可溶性糖接菌组整体低于对照，且接菌组均出现先降低后升高的趋势，本试验结果与前人研究结果不一致，原因可能是菌根真菌先从宿主植物上吸收糖类物质转化自身的能源物质，后促进宿主植株糖分的积累。

植物激素是生理作用中最重要的一种物质，在植物的生长发育中发挥重要的协调作用。试验中杜鹃苗在接菌组中内源激素高于对照，且在接菌处理下养分需求少于对照组，结果表明当养分过高或过低时，菌根共生体为应对这种养分过高或过低的不良情况，通过分泌激素或刺激植物分泌激素，启动逆境防御反应，提高保护酶活性，降低膜脂过氧化程度，增强杜鹃苗的抗逆能力，平衡养分吸收，而接菌处理在少量养分条件下更多地刺激分泌植物激素也表明混合接种能有效降低植物需肥量，刺激激素的分泌合成。

通过对杜鹃苗各项生理指标进行相关性分析和主成分分析得出：第l主成分贡献特征向量较大的为Chl、SOD、POD、CAT、SP、IAA、ZR和GA₃，其特征值为6.853，贡献率为62.299%;第2主成分贡献特征向量较大的为Chl、SOD、MDA、SP、IAA、ZR、ABA，其特征值为1.648，贡献率为14.891%，累积贡献率为77.280%。本研究对主成分得分构建了排序示意图，除MDA、ABA、SS、CAT、ZR、POD位于负象限内以外，其余5个生理指标均位于正象限以内，得出Chl、SOD、SP、IAA和GA₃含量可以作为反映杜鹃苗生长的主要指标。