吴明基 林艳 刘华清 付艳萍 宋亚娜 王锋

摘要：[目的]利用基因编辑技术编辑水稻香味基因，改良优质粳稻香味性状。[方法]构建CRISPR/Cas9-BADH基因编辑载体，转化优质粳稻品种龙稻18、龙稻24和秀水134，测序鉴定3个优质粳稻品种的香味基因Betaine aldehyde dehydrogenase 2（Badh2）突变体并分析潜在脱靶效应，利用气相色谱-质谱联用技术测定不同遗传背景badh2突变体稻米的2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）含量。[结果]转化获得的30株To为badh2突变体，其中53.33%为杂合型突变，16.67%为纯合型突变，10%为双等位突变类型。T1代非转基因植株内共鉴定获得7种纯合badh2突变基因型。在5个预测位置上未检测到脱靶事件的发生，说明设计的sgRNA具有高度特异性。所有Badh2移码突变体稻米的2AP含量都达到或高于稻花香的水平，但不同品种来源的badh2突变体间2AP含量差异极显著。[结论]本研究提供了一个能够高效诱导水稻Badh2突变的CRISPR/Cas9定向编辑靶点，改良了生产上大面积推广的3个优质水稻品种龙稻18、龙稻24和秀水134的香味性状，发现了不同遗传背景的水稻badh2突变体间2AP含量差异显著，为基于定向编辑Badh2基因的方法培育适合生产应用的香稻品种、提高育种效率提供科学依据。

关键词：水稻;香味;Badh2;CRISP/CAS9;2-乙酰-1-吡咯啉

中图分类号：S511文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）05-0465-09

0引言

（研究意义）随着人们生活水平的改善，对稻米品质的要求也日益提高。香米因其独特的芳香气味而倍受消费者欢迎，其市场价格远高于非香味稻米。因此，香味性状已成为重要的优质稻育种目标，倍受水稻育种家重视。采用基因编辑技术，定向突变香味性状基因Badh2，可提高水稻香味性状选育效率，加速香稻品种育种进程。（前人研究近展）2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）是形成米饭香味的最主要成分，香米中的2AP含量比非香米增加约两个数量级以上。目前，决定水稻香味的基因Badh2（Betaine aldehyde dehydrogenase 2，LOC Os08g32870）已经成功克隆，该基因包含15个外显子，由503个氨基酸组成，编码甜菜碱醛脱氢酶。前人研究表明，Badh2能够催化2AP合成前体4-氨基丁醛的氧化，普通水稻由于Badh2正常表达导致稻米不能积累2AP而不具有香味，水稻badh2突变体由于Badh2突变并失去功能，可有效积累2AP，从而形成香稻米的特有香味。近年来，以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术快速发展，作为新一代的育种技术，CRISPR/Cas9具有操作简单、快速高效等优点，已经成功运用于多种农作物重要农艺性状的编辑改良。已有研究报道了利用基因编辑技术对水稻Badh2进行定点编辑，改良了日本晴、中花11和东农425等水稻品种的香味性状，提供了一种快速培育香稻品种的技术途径。（本研究切人点）但相关研究仍然较少，鲜有利用基因编辑技术改良当前生产上主推水稻品种香味性状的报道。（拟解决的关键问题）本研究构建了靶向水稻Badh2基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以目前生产上大面积推广应用的优质稻品种龙稻18、龙稻24和秀水134为香味性状改良对象，期望通过定向敲除Badh2基因功能，改良3个品种的香味性状，提升市场价值。探讨不同遗传背景badh2突变体的2AP含量变化规律，评价新创制材料的育种利用价值，旨在为基于定向编辑Badh2基因的方法培育适合生产应用的香稻品种提供科学依据。

1材料与方法

1.1水稻材料及种植管理

粳稻品种秀水134（由浙江省嘉兴市农业科学院提供），龙稻18、龙稻24、稻花香（由黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所提供）。所有水稻材料均种植于福建省农业科学院生物技术研究所福州寿山试验基地温室或实验田内，按照常规方法进行正常田间种植及管理。

1.2载体构建及遗传转化

利用http：//www.e-crispr.org/网站，选择水稻Badh2基因第一外显子上的23bp序列（5-CCCCATCGGTACCCTCCTCTTCA-3）作为sgRNA靶点。由铂尚生物技术（福州）有限公司合成引物序列BADH2-S与BADH2-A（表1），利用北京唯尚立德生物科技有限公司提供的VK005-1质粒构建试剂盒，将引物二聚体克隆到pVK005-1中。将构建好的质粒通过热激转化到DH5a大肠杆菌感受态细胞。每个载体各挑取3个正常生长的单克隆培养，随后送到铂尚生物技术（福州）有限公司测序，测序引物序列为5'-AGCCATGAATAGGTCTATGAC-3，序列正确的质粒载体命名为CRISPR/Cas-9-BADh.提取上述质粒，将CRISPR/Cas-9-BADH质粒载体电击导人LBA4404感受态细胞中，参照苏军等的方法，通过农杆菌介导的方法转化龙稻18、龙稻24和秀水134的愈伤组织，获得T₀代植株。

1.3转基因植株鉴定

使用CTAB法从水稻叶片中提取基因组DNa.以T₀代各单株的基因组DNA为模板，通过上游引物Hptr和下游引物Hptk（表1）PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因（Hpt）鉴定转基因植株。以T1和T2代各单株的基因组DNA为模板，通过HptF/HptR进行PCR扩增Hpt基因，无目的条带的單株即为分离出的非转基因植株。

1.4 靶位点突变分析及潜在脱靶检測

以Badh2基因组序列为参考，设计并合成正向引物BADHF和反向引物BADHR（表1）。以此对特异性引物通过PCR扩增T₀、T₁和T₂代各植株的Badh2基因组序列，将PCR产物送铂尚生物技术公司（福州）进行测序，鉴定Badh2突变体。利用龙稻18、龙稻24及秀水134背景的18个T₁代非转基因突变体（每个品种各6株）进行CRISPR/Cas-9-BADH质粒载体潜在的脱靶突变检测。通过在线工具CRISPR-P2.0预测该质粒在水稻基因组上的潜在脱靶位置，设计并使用特异性引物（序列见表1）对潜在的脱靶位点序列进行PCR扩增并测序鉴定。

1.5 稻米香味物质2AP提取及测定

稻米2AP含量由南京卡文思检测技术有限公司检测。以各野生型品种及T₂代badh2纯合突变体的稻米作为2AP含量测试样品，以无水乙醇萃取稻米样品中的2AP，利用气相色谱-质谱联用仪测定样品2AP含量，每个样品测定3次重复。通过测定不同浓度梯度的2AP标准品建立校准曲线，利用校准曲线计算供试样品2AP含量。

1.5.1稻米2AP提取及标准品配制 取待测稻谷样品，种子去壳后于液氮中研磨粉碎，称量约1.0g粉末加入钳口瓶中，加入1mL无水乙醇，钳口瓶置于水浴锅中60℃水浴萃取4h，冷却至常温，打开瓶盖，吸取200uL上清，过0.22um滤膜后加入进样瓶。以无水乙醇为溶剂配制梯度为0.005、0.01、0.05、o.1、1.0ug·mL^-1的2AP标准品溶液各1.0ml.

1.5.2气质检测 气相色谱条件：色谱柱Rtx-5MS（30m×0.25mm×0.25um），恒线速度37.0mL·min^-1，柱箱升温程序为：50℃初始温度保持2min，以10℃。min^-1速率升温至280℃并保持3min，进样口温度为170℃，载气为高纯（纯度>99.999%）氦气，高压不分流进样，每个样品进样量为1.0ul.质谱条件：电子轰击（EI）离子源，离子源温度为230℃，离子化能量为70eV，接口温度为280℃，多反应模式（MRM）扫描，检测参数设定为前体离子111.0，产物离子69.00，定量离子83.00，碰撞能量6.00v.

2 结果与分析

2.1转基因T₀代水稻Badh2基因突变鉴定

构建CRISPR/Cas9-BADH质粒载体，利用农杆菌介导法将该质粒转入龙稻18、龙稻24和秀水134的愈伤组织，共获得了35株T₀代水稻材料，其中龙稻18有10个克隆，龙稻24有12个克隆，秀水134有13个克隆。转基因阳性植株鉴定结果显示，35株T₀代中共有30株为转基因阳性克隆，其余5个植株为阴性非转化材料（图l、表2）。

为了解转基因阳性植株Badh2基因的突变情况，利用BADHF和BADHR特异性引物（表1）PCR扩增上述30个转基因阳性植株的Badh2基因靶位点序列，并对PCR产物进行测序鉴定，结果列于表2.由统计结果可知，在龙稻18、龙稻24和秀水134的转基因T₀代中，约有80%植株的Badh2基因发生了突变。产生的突变基因类型包括纯合型、杂合型及双等位突变基因型，其中53.3%为杂合型突变，16.67%为纯合突变，双等位突变类型占10%。不同品种产生的3种类型突变比率略有不同，11株秀水134转基因植株内，有9株Badh2基因产生了突变，包括2株纯合突变，1株双等位突变，其余6株为杂合型突变。而8株龙稻18转基因T₀代中，有6株杂合型突变，1株纯合突变，1株为野生型，没有产生双等位突变。以上鉴定结果表明，利用CRISPR/Cas9-BADH质粒可高效编辑水稻Badh2基因。

2.2 非转基因badh2纯合突变体鉴定

收获上述24株发生突变的T₀代植株自交种子，种植相应的T、代，筛选出非转基因植株后进行各个单株的Badh2基因型鉴定。所有T₁代单株内共鉴定出7种纯合badh2突变基因型，结果列于图2及表3.这些纯合突变类型中，LD24badh2-#4和XSl34badh2-#6缺失了3个和6个碱基，未造成阅读框移码，也未提前形成终止密码子，可能不会影响Badh2基因的功能。在22个移码突变中，只有XSl34badh2-#2和LDl8badh2-#1为插入单碱基A的相同突变，其余都是碱基缺失突变类型。在这些缺失突变类型中，有14个株系都为缺失同一个胞嘧啶的纯合突变，另有4个株系是缺失相同4个碱基的纯合突变（表3）。这些移码突变位置处于第一外显子，改变了其后所有氨基酸的序列，可导致这些突变基因都不能翻译成具有正常功能的Badh2蛋白，因此推测这些移码突变体可能产生并积累2AP香味物质。

2.3潜在脱靶效应检测

经CRISPR-P2.0在线预测，在水稻全基因组上检索到5个潜在脱靶概率较高的位点，都位于基因的外显子区域，这些位点的序列与BADH载体的靶点存在2～4个错配碱基。分别将这5个位点命名为BSl、BS2、BS3、BS4和BS5（表4）。其中，BSl、BS2、BS3的序列完全相同，但是它们分别位于水稻第2号、第6号及第10号染色体上。利用特异性引物（表1）通过PCR分别扩增了上述5个目的位点的基因序列，对获得的PCR产物测序分析，结果显示，在所检测的18个T₁代非转基因突变体中，所有5个被检测的位点上都未发现序列突变（表4）。以上脱靶效应分析结果说明CRISPR/Cas9-BADH载体具有较高的特异性，不容易产生脱靶。

2.4 香味物质2AP含量的测定与分析

首先，利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）测定5种不同浓度梯度2AP标准品溶液的总离子流图峰面积，建立校准曲线，得到回归方程为y=237389x+201.1（R²=0.9986）。根据该回归方程，将每个样品所测得的2AP总离子流图峰面积換算成对应样品的2AP含量（图3～4）。结果显示，秀水134、龙稻18、龙稻24及XSl34badh2-#6（缺失6个碱基的株系）的2AP含量约为0（0～0.003ug.g^-1），对照品种稻花香的2AP含量为0.182ug·g^-1。所有9个Badh2基因移码突变体的稻米中都检测到一定浓度的2AP含量，但不同突变体的2AP含量在品种间达到极显著差异水平。其中，秀水134badh2突变体稻米2AP含量与对照稻花香的无显著差异。龙稻24和龙稻18背景的badh2突变体稻米2AP含量都极显著高于稻花香稻米的2AP含量（图4）。以上结果表明，Badh2基因移码突变体水稻可积累香味物质2AP，但不同品种间稻米的2AP含量差异显著，提示不同水稻品种合成2AP的能力可能存在差异。

3 讨论与结论

香味是水稻的重要品质性状，倍受育种家关注。目前，人们普遍利用香稻品种作为香味基因供体，采用常规杂交育种方法进行香稻选育，随着一系列Badh2等位基因相关功能标记的开发利用，香味基因分子标记辅助选择大大提高了香稻育种的选择效率。然而，这些育种方法存在着劳动强度大，成本高、育种周期长等缺点。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术已用于精确的水稻遗传育种改良，该项技术在水稻香味基因改良方面已有相关报道，但鲜有通过基因编辑改良当前生产上大面积推广应用品种香味性状的报道。本研究在水稻Badh2第一外显子上设计了一条sgRNA靶序列，构建了CRISPR/Cas9载体，以龙稻18等3个优良品种为香味性状改良对象，突变序列分析表明CRISPR/Cas9系统在该sgRNA靶点具有很高的基因编辑效率，所诱导的突变率可达到72.7%～87.5%。該位点上产生的突变类型以1～7个碱基的小片段缺失为主，而且多数克隆（14/24）只在靶点处缺失1个胞嘧啶。发生插入突变的比率显著低于缺失突变的比率，只有XSl34badh2-#2和LDl8badh2-#l产生了同一种类型的单碱基A插入突变，产生这种突变特征的原因可能跟Badh2基因的靶点序列特征有关。Zhang H等利用CRISPR/Cas9在11个水稻基因上产生的所有突变中，超过半数的突变类型为单碱基的插入突变，且插入的碱基以A和T为主。但是，不同基因上产生的突变类型显著不同，例如DERFl基因上产生的突变类型有79.1%的为插入突变，而YSA基因上产生的突变有84.3%是碱基缺失突变类型。因此，在CRISPR/Cas9诱导基因突变过程中，由于不同靶点的序列特征差异，所产生的突变类型可存在明显的差异性。潜在脱靶效应分析表明，虽然在基因组上存在2～4个错配碱基的潜在脱靶位点，但在已检测的所有18个植株中，并未在潜在脱靶位点检测到脱靶事件的发生，说明该基因编辑靶点的特异性很高。

2AP是形成稻米香味的主要成分，其含量的高低决定了稻米香味的程度。龙稻18、龙稻24和秀水134等3个优质稻品种所测得的2AP含量极低，品种间差异不显著，但是不同品种来源的badh2突变体间，2AP含量差异达到极显著水平（图4）。由于3个野生型品种的Badh2有功能，无法正常积累2AP，所以3个野生型品种稻米的2AP含量极低，品种间差异不显著。推测这3个不同品种间4-氨基丁醛的代谢合成能力可能在存在显著差异，因此当Badh2突变后，不同品种的badh2突变体所积累的2AP含量产生了极显著差异。所测材料中，XSl34badh2-6株系也无法正常积累2AP，这可能是由于该突变缺失的碱基数是6个，所翻译的Badh2蛋白只是缺少了两个氨基酸，并未改变Badh2蛋白的功能，导致XSl34badh2-6株系2AP含量与原品种秀水134无显著差异。此外，龙稻18badh2突变体2AP的平均含量约为香稻品种稻花香的2.5倍，应用咀嚼法鉴定，就能明显区分龙稻18香味突变体及稻花香之间的差异，可利用龙稻18badh2突变体开展浓香型优质水稻品种选育。

本研究以当前生产上主推的3个优质粳稻品种进行香味改良，其中，龙稻18是黑龙江省首个达到国家一级米标准的粳稻品种，食味品质优，该品种在2018年获得首届“全国优质稻品种食味品质鉴评金奖”。龙稻24产量潜力大，米质达国标优质稻二级。秀水134属于单季常规晚粳，该品种具有米质优、产量高、抗倒性好、适合直播、稻瘟病抗性强等特点。但是这3个品种都不是香稻品种，可进行香味性状改良，提升品种价值。通过CRISPR/Cas9基因编辑，在T₁代获得了3个品种非转基因香稻株系，虽然品种间2AP含量差异极显著，但都达到或超过了香稻品种稻花香的2AP含量，符合香味改良育种目标，能够满足市场需求。其中国标l级米品种龙稻18背景的badh2突变体稻米2AP平均含量是0.466ug·g^-1，是香稻品种稻花香的2～3倍，有望从中选育出高档香型优质米品种，具有重要的育种利用价值。