杜 宇,张皓冰,杨宇琪,汪 妍,赵红燕,林炽贤

(1.海南热带海洋学院 a.水产与生命学院;b.海南省两栖爬行动物研究重点实验室,海南 三亚 572022;2.杭州师范大学 生命与环境科学学院,杭州 311121)

0 引言

单链抗体又称单链抗体可变区片段(Single-chain antibody variable fragment,ScFv)，是一类极具潜力的基因工程抗体，分子量小、特异性强及异源性低的特点使其能精准地与抗原结合，与传统方法制备的抗体相比，还能有效降低对机体的过敏反应[1-2].目前，制备单链抗体的方法多为将单链抗体基因通过体外重组插入载体，转化至大肠杆菌中大量扩增和表达，大大增加基因的拷贝，使得筛选优良单链抗体基因更加简便[3-6].单链抗体研制已经成为当前研究的热点，相关技术也已十分成熟.其中，噬菌体展示技术可以将表型和基因型有机地联系在一起，不经人体免疫和杂交瘤技术便可实现体外筛选富集，可直接制备人源化基因工程抗体，也可通过改造实现非人源化抗体基因的人源化，是当前被广泛研究和运用的单链抗体研制技术[7-9].

本研究以平颏海蛇(Hydrophiscurtus)蛇毒免疫小鼠，通过诱导其产生免疫应答以获取脾脏总RNA并构建cDNA文库，利用PCR技术扩增抗体重链(VH)可变区和轻链(VL)可变区基因片段并拼接成ScFv基因，重组至噬菌体并转化TG1敏感菌，用辅助噬菌体侵染建立蛇毒蛋白抗体ScFv噬菌体文库，最终从文库中初步筛选获得阳性克隆.该研究的成功可为继续制备性能稳定、特异性强、亲和力高和效能多样的鼠源性单链小分子抗体及其人源化改造提供基础.

1 材料与方法

1.1 蛇毒与试剂

本实验用的平颏海蛇毒冻干粉为本实验室自有制品.弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自Sigma公司；cDNA反转录试剂盒和Taq酶购自Abm公司；核酸提取试剂盒、质粒制备试剂盒、PCR清洁试剂盒、Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶、载体和T4连接酶购自TakaRa公司；TG1菌株和M13K07辅助噬菌体购自GE公司；氨苄、卡那霉素、感受态细胞、LB培养基粉及其他分析纯试剂均购自上海生工.所有引物合成及测序皆由上海生工完成.

1.2 小鼠免疫

选择2只10周龄Balb/c小鼠用于蛇毒免疫.称取足量可供整个免疫过程所需的平颏海蛇毒冻干粉，用生理盐水配制成10 g·L-1母液，用0.22 μm针式滤头过滤，随后保存于-20 ℃冰箱中备用.按照0.02 μg·g-1的蛇毒剂量对小鼠进行首程免疫，免疫前吸取足量母液至1.5 mL离心管，于90 ℃水浴30 min灭活，后加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化彻底后按每只300 μL的剂量腹腔注射小鼠.第2～3周按照0.05 μg·g-1和0.1 μg·g-1的剂量分别进行2次加强免疫，灭活后蛇毒用弗氏不完全佐剂乳化，注射方式同首程免疫.

1.3 小鼠脾脏总RNA提取及cDNA反转录

第2次加强免疫7 d后，摘取小鼠新鲜脾脏，于液氮预冷的研钵中快速研磨至粉末状，按照核酸提取试剂盒操作方法提取脾脏总RNA.检测总RNA的纯度及浓度达到要求后，按照5×All-In-One RT MasterMix 试剂盒说明书去除基因组DNA并反转录cDNA第1链.

1.4 单链抗体基因构建

以cDNA为模板，分别扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)片段[8-9].所用引物为：重链上游引物TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC，重链下游引物AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG；轻链上游引物CCGTTTGAT-TTCCAGCTTGGTGCC，轻链下游引物GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA；linker引物GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCACTCGAGTGG与TGGAGACTGG-GTGAGCTCAATGTCCTGTGCACT；带内切酶位点全长ScFv基因的上游引物GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC，下游引物GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG.反应体系为：DNA模板0.8 μL，引物各0.4 μL，2×PCRTaqMasterMix 10 μL，去离子水补至20 μL.反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火55 s，72 ℃延伸70 s，共30次循环；72 ℃再延伸10 min.用 1%琼脂糖凝胶检测扩增产物.纯化 PCR 产物连接 PMD-19T 载体，连接体系为10 μL，连接好的克隆载体转化感受态细胞 DH5α，涂布到氨苄青霉素浓度100 mg·L-1的平板上，37 ℃培养过夜后，挑取单菌落摇菌扩增.以测序成功的VH和VL质粒与相匹配的linkerDNA 三者互为模板.采用重叠延伸拼接 PCR(SOE-PCR)重组为单链抗体片段(ScFv)，反应体系为：质粒各0.8 μL，linkerDNA 1.6 μL，2×PCRTaqMasterMix 10 μL，去离子水加至20 μL.反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，63 ℃退火55 s，共7次循环后，72 ℃延伸10 min，将VH和VL拼接为ScFv.

在ScFv基因的5'和3'端分别引入Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点，设置反应体系为：RS引物混合物0.4 μL，2×PCRTaqMasterMix 10 μL，去离子水加至20 μL.反应条件为：94 ℃变性1 min，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸10 min，25次循环后，再72 ℃延伸10 min.得到单链抗体片段后，连接转化至DH5α，涂布平板，培养过夜.挑取阳性菌落经质粒抽提后送检测序.

1.5 单链抗体基因重组与转化

用限制性内切酶Sfi Ⅰ和Not Ⅰ对测序成功的质粒进行双酶切消化，反应体系：质粒1 μg，10×QuickCut Buffer 5 μL，Sfi Ⅰ酶和Not Ⅰ酶各1μL，加水补足至50 mL.吹吸混匀后于37 ℃水浴孵育30 min，再转移至50 ℃孵育30 min.产物经纯化后与同样酶切后的载体pCANTAB-5E以摩尔比3︰1进行连接，反应体系：10×连接缓冲液2 μL，pCANTAB-5E 50 ng，T4 DNA连接酶1 μL，用灭菌水补足至20吹吸混匀后置于16 ℃连接过夜.

取20 μL上述重组产物与40 μL TG1敏感菌混匀，冰上放置45 min，42 ℃ 2 min，再迅速转移至冰上放置2 min；后加入190 μL 2×YT培养基于37 ℃培养1 h.随后铺SOBAG板，30 ℃过夜，以未转化的TG1为对照.

1.6 单链抗体库扩增与筛选

用2×YT培养液洗SOBAG板上的转化克隆，并在37 ℃摇床培养至OD600达到0.4后加入M13K07辅助噬菌体，37 ℃摇床继续培养1 h.随后，培养液离心(4 000 r·min-1， 4 ℃，10 min)后去上清，用2×YT-AK(含100 mg·L-1氨苄青霉素和50 mg·L-1卡那霉素)培养液重悬沉淀后于37 ℃摇床培养过夜.培养液在4 ℃条件下10 000 g离心10 min，取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl(20%聚乙二醇6000，2.5 mol·L-1氯化钠)，在冰上放置1 h，随后在4 ℃条件下10 000 g离心10 min ,2次沉淀噬菌体，最后用5 mL PBS溶液重悬沉淀.

将含10 mg·L-1平颏海蛇毒粗毒的0.1mol pH 9.6碳酸钠-碳酸氢钠溶液加至细胞培养瓶，4 ℃过夜包被.经10 mmol pH 7.4 PBS清洗3次后，加入含10%脱脂奶粉的10 mmol pH 7.4 PBS，于37 ℃封闭1 h.经PBS清洗后，加入20 mL噬菌体展示单链抗体文库，37 ℃孵育2 h.随后，用PBST洗涤15次，再用PBS洗涤10次以去除非特异性结合的噬菌体.加入10 mL处于对数期的TG1菌液，37 ℃摇床培养1 h.将产物转入离心管中，加入M13K07辅助噬菌体、氨苄和2%葡萄糖，37 ℃摇床继续培养1 h.4 000 r·min-1离心10 min，重悬沉淀于2×YT-AK，37 ℃过夜.之后的各轮富集时均加入10 mL噬菌体展示单链抗体文库.

1.7 单链抗体噬菌体ELISA检测

经过5轮吸附—洗脱—富集筛选后，对筛选所得的单链抗体噬菌体进行ELISA检测.用质量浓度为10 mg·L-1的平颏海蛇毒包被96孔板，每孔100 μL，4 ℃过夜.PBST清洗3次后，用含2%脱脂奶粉的PBST溶液于37 ℃封闭1 h.经PBST清洗3次后，加入筛选所得产物，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h.再用PBST清洗3次，随后加入鼠抗M13抗体，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h.用PBST清洗后，加入HRP标记的兔抗鼠抗体，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h.最后用PBST清洗5次，加入TMB底物液，反应20 min后用2.5 mol·L-1硫酸终止反应.用SpectroMax 384酶标仪读取450 nm下的吸光值.

2 结果与分析

2.1 单链抗体基因的构建

用 1%琼脂糖电泳检测小鼠IgG轻链可变区、重链可变区和单链抗体片段的扩增产物显示，轻链和重链可变区片段分子质量分别约为320和360 bp(图1)，单链抗体片段约为750 bp(图2)，与NCBI数据库公开的鼠源IgG轻链、重链和单链抗体片段长度相符.3种片段的PCR产物经测序后与NCBI数据库公开数据比对结果显示，轻链和重链可变区片段分别与小家鼠IgG轻链、重链可变区片段高度相似，相似度均大于95%(图3)，表明目的片段扩增并连接成功.

*为相同碱基.图3 ScFv片段序列相似性比对结果注：H2为ScFv片段中的重链可变区片段；L2为ScFv片段中的轻链可变区片段；K2为小家鼠IgG重链可变区片段-NCBI登录号KF208249；A2为小家鼠IgG轻链可变区片段-NCBI登录号AY374128.

2.2 单链抗体基因重组噬菌体转化

将携带有单链抗体基因的重组噬菌体转化至大肠杆菌TG1感受态细胞，倒SOBAG平板，经30 ℃过夜培养后，有明显克隆长出；对照组为未经转化的TG1菌，在30 ℃过夜培养后，无克隆长出，结果表明重组噬菌体转化成功(图4).

图4 重组噬菌体转化TG1效果注：左图为重组噬菌体阳性克隆组；右图为对照组.

2.3 单链抗体噬菌体阳性克隆筛选

经过5轮吸附——洗脱——富集筛选后，以平颏海蛇毒蛋白为包被抗原，用筛选所得的单链抗体噬菌体进行ELISA检测免疫效价.结果显示，2个阳性组(P1和P2)的OD平均值分别为0.15和0.17，对照组(C)的OD平均值为0.10(图5).阳性组的信号强度微弱.

图5 阳性和阴性克隆OD值的比较注：C为阴性克隆；P1、P2为阳性克隆.

3 讨论

与传统抗体制备技术相比，基因工程抗体制备技术能有效改造并获得抗体功能作用片段，经过精简后的抗体分子将发挥更为专一的作用，并提高单位剂量抗体制剂的效价[10]2.同时，由于去除了非功能结构，也将有效降低抗体过敏反应[11-13].抗蛇毒血清是当前治疗毒蛇咬伤的最佳药物，全球每年的蛇伤危害较为严重.由于传统方法制备抗蛇毒血清周期长、成本高、保存期短以及相较于其他药物的需求较小等一系列问题，导致生产企业的生产积极性不高，常常出现供需失衡[14-16].平颏海蛇为眼镜蛇科海蛇属毒蛇，其毒液是多种酶和多肽的混合物，毒性强烈，是我国海域中常见的有毒爬行动物，对海上作业及近海旅游等造成了一定的危害.国内至今仍缺少治疗该种毒蛇咬伤的抗体类药物，利用基因工程技术改造并制备平颏海蛇毒单链抗体有望为制备新型小分子抗海蛇毒药物提供参考.

1990年,Mccafferty等[17]最早通过 PCR 扩增机体抗体可变区基因并重组表达于噬菌体表面，构建噬菌体抗体库.利用噬菌体展示技术制备单链抗体，已成为当前抗体研制的热点之一[10]1.该技术是一种高效基因表达筛选技术，将外源蛋白或多肽与特定的噬菌体衣壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持相对独立的空间构象和生物活性，有利于靶分子的特异性识别及结合，从而实现基因型和表现型的统一.有别于传统的单克隆抗体技术，噬菌体展示技术可对各种抗原进行高通量筛选，快速获得抗体片段，从而迅速得到广泛应用.将单链抗体连接pCANTAB-5E载体并转化至大肠杆菌TG1感受态细胞扩增，建立单链抗体库.抗体库的库容量和多样性是决定抗体库质量的两个重要的指标.库容量越大，从中获得高亲和力抗体的可能性就越大；多样性好，从中筛选到不同目的抗体的概率就大.

本研究用平颏海蛇毒腹腔注射小鼠进行周期性免疫，以诱导小鼠免疫系统对海蛇毒产生应答，获取可编码识别该种蛇毒组分的小鼠免疫球蛋白mRNA.制备单链抗体基因时，使用RT-PCR技术结合SOE-PCR技术，以cDNA为模板扩增抗体重链和轻链可变区片段并以linker相连，此方法可以免去限制性内切酶消化，连接酶的处理等环节，只需在设计引物时引入重叠区域就可以实现目的片段之间的有效拼接[18-19].利用特定引物扩增的轻链和重链可变区片段及单链抗体基因经琼脂糖凝胶电泳验证无非特异性条带出现，经纯化后去除引物二聚体便可得到较为纯净的目的基因，测序结果也进一步证明了所得基因片段的准确性，可用于后续表达载体的构建.

尽管本研究已构建了相应的单链抗体库，但在用ELISA检测由平颏海蛇毒筛选过的噬菌体文库时，并未达到理想效果.五轮筛选的阳性克隆吸光值较低，无法呈现强阳性检测效果，可能在筛选过程中，存在较多的非特异性的融合噬菌体，还可能是由于噬菌体浓度过低.因此，在对单链抗体噬菌体文库筛选过程仍然需要进一步改善和优化.应在筛选过程中，通过进一步构建次级库，改进洗脱条件，增加筛选模式等措施以使阳性重组噬菌体得到有效富集.本研究尝试了利用基因工程技术构建平颏海蛇毒单链抗体并建立了单链抗体噬菌体展示文库，初步尝试筛选单链抗体，总结了一套切实可行的实验方案，后期应进一步提高阳性富集效果.