王欢欢，宋丹丹，葛莹，张雷，楼立峰，章学东

(杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

蛋壳是鸡蛋的重要组成部分，起着支撑、保护蛋内容物和胚胎的作用，同时也是壳内物质与外界环境的沟通渠道。鸡蛋的运输、贮存和孵化等过程与蛋壳质量密切相关，蛋壳质量是衡量鸡蛋品质的重要指标。蛋壳质量主要包括蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数、表面暗斑、蛋壳微观结构等。蛋壳由高度有序的多层膜和钙化基质构成，可分为壳膜、乳突层、栅栏层、晶体层和表层等[1-2]。在蛋壳形成过程中，表层沉积了由蛋壳腺上皮细胞分泌的原卟啉、胆绿素及其锌螯合物等不同色素物质，从而呈现出褐、粉、白、蓝、绿等多种蛋壳颜色。已有研究发现，蛋壳颜色与种蛋的孵化率有一定的相关性[3-4]。实际生产中，绿壳鸡蛋的出雏率相对较低。本试验对孵化后期的绿壳鸡蛋进行喷醋处理，并分析孵化前后蛋壳超微结构的变化，结合雏鸡出壳的情况，以期为提高绿壳鸡蛋孵化效率提供参考。

1 材料与方法

1.1 处理设计

试验所用绿壳鸡蛋产自杭州市农业科学研究院自行培育的BG系乌骨鸡。随机选择种蛋210枚(选取其中5枚作为A组，不进行孵化)，进入全自动孵化箱孵化，第10天通过照蛋确定受精种蛋。第18天时，将192枚受精蛋平均分为2组(B组和C组)，B组按常规转入出雏箱，继续孵化至雏鸡出壳；C组转出雏箱后，每天用5%醋酸喷湿种蛋表面1次，直至雏鸡出壳。

1.2 电子显微镜观察

选择进箱孵化前种蛋的蛋壳(A)、常规孵化出雏后的蛋壳(B)、喷醋处理出雏后的蛋壳(C)各5个，剥除蛋壳内膜。在每个蛋壳样本的清洁、干燥、平整度好的一致区域，选取小片蛋壳，粘贴到进样台上，喷金，然后置入HITACHI SU-70型扫描电子显微镜下观察。

1.3 数据分析

统计常规孵化组(B)和喷醋处理组(C)的受精种蛋数和出壳雏鸡数，计算受精蛋出雏率，采用SPSS 21.0软件进行卡方检验。运用Image Pro Plus软件测算各个镜检样本的蛋壳厚度、乳突层和有效层厚度、气孔数、气孔面积等，并用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析。数据以“平均值±标准差”表示，差异显著性以P<0.05为有统计学上意义。

2 结果与分析

2.1 蛋壳内表面

如图1所示，孵化前的蛋壳虽已剥除肉眼可见的壳膜，但仍可见大量纵横分叉、粗细不等的蛋白质纤维，层叠交织形成比较致密的网状结构，蛋白纤维表面有很多颗粒状的突起和结节，可能起到加固、联结作用。蛋壳孵化出雏后，内表面蛋白纤维消失，乳突椎体暴露，椎体前部已经崩解呈蜂窝状。

图1 各组别蛋壳内表面的电镜观察(400×)

2.2 蛋壳横断面分层结构

蛋壳由内到外可分为壳膜、乳突层、栅栏层、晶体层和表层。

孵化前蛋壳分层结构比较清晰、各层排列紧密，内层壳膜明显；孵化后蛋壳结构疏松，层级模糊，壳膜消失(图2)。

图2 各组别蛋壳横断面的电镜观察(200×)

蛋壳厚度测量结果见表1。常规孵化后和喷醋处理孵化后的平均蛋壳厚度分别为276.3、275.4 μm，均显著低于孵化前的平均蛋壳厚度(P<0.05)。其中，孵化后蛋壳的乳突层厚度均显著低于孵化前蛋壳(P<0.05)，而有效层厚度差异不显著，表明孵化前后蛋壳厚度的变化主要源于乳突层厚度的变化。

表1 各组别的蛋壳厚度

2.2.1 乳突层

蛋壳乳突层紧贴壳膜，其基本结构是锥核和乳突单元。孵化前蛋壳的乳突单元排列整齐、紧致，锥核明显；孵化后蛋壳的乳突单元松散，锥核崩解，圆锥形顶部几乎消失，乳突层厚度下降(图3)。

2.2.2 栅栏层

栅栏层紧贴乳突单元，是蛋壳的主体结构部分。栅栏层由致密堆叠的块柱状单元组成，密布大小、形状和深浅不一的孔洞，可以有效化解应力、提高强度；孵化前后，3组蛋壳的栅栏层厚度、质地似无明显差别(图4)。如表2所示，孵化前后，蛋壳栅栏层的孔洞数无显著差异。

表2 各组别栅栏层孔洞的分布情况

图3 各组别蛋壳乳突层的电镜观察(1 500×)

图4 各组别蛋壳栅栏层的电镜观察(6 000×)

2.2.3 晶体层和表层

晶体层紧接栅栏层，具有一些小的孔洞。从图5可见，孵化前蛋壳晶体层中的内层方解石结构呈伞状紧密排列，外层颗粒致密；孵化后蛋壳的晶体层无伞状排列，颗粒比较松散，喷醋处理组蛋壳晶体外层更加疏松。孵化前，蛋壳表面角质层清晰可辨，表层可见裂隙；孵化后，蛋壳角质层消失。

图5 各组别蛋壳晶体层的电镜观察(6 000×)

2.3 蛋壳外表面

孵化前蛋壳外表面比较光滑，龟背状裂纹多而细长，边缘清晰，裂隙窄而深；常规孵化后，蛋壳外表面比较粗糙，裂纹相对较少，裂隙宽而浅；喷醋处理后，表面裂纹更少，蛋壳外表面有颗粒物堆积(图6)。

2.4 孵化出雏结果

常规孵化和喷醋处理后孵化，受精蛋出雏率分别为81.3%、86.5%，组间差异不显著。

3 讨论

3.1 孵化前后蛋壳超微结构变化

乳突层是蛋壳形成过程中壳膜蛋白纤维开始钙化的部位，乳突单元与壳膜的联系、乳突之间排列是否规则整齐将直接影响蛋壳其他各层的形成，从而决定蛋壳质量[5]。在鸡胚发育过程中，初期钙源主要来自蛋黄；鸡胚发育中后期，乳突锥核中的钙微晶颗粒成为胚胎发育的主要钙源[6]。本研究中，孵化后蛋壳的乳突层结构变化显著，壳膜消失，乳突外露，乳突表面呈蜂窝状凹陷，厚度显著低于孵化前。乳突结构的破坏从内部降低了蛋壳的强度，有利于雏鸡从内部啄破蛋壳。

本研究中，孵化前后蛋壳的栅栏层和晶体层厚度变化较小。碳酸钙是蛋壳的主要成分，常以方解石、霰石、球霰石等3种形式存在于自然界中，方解石最稳定[7]。孵化前晶体层碳酸钙以方解石形态存在，排列细密有序；孵化后的蛋壳结构疏松失序，可能与部分钙质流失有关[8]，蛋壳结构致密性降低，同样使蛋壳强度下降，利于雏鸡出壳。

A～C分别为孵化前、常规孵化、喷醋处理后蛋壳(200×)；D～F分别为孵化前、常规孵化、喷醋处理后蛋壳(6 000×)。图6 蛋壳外表面的电镜观察

蛋壳表面角质层主要由糖蛋白类、多糖、脂类、色素、无机磷酸盐等组成[9]，能隔绝外界环境，防止蛋内水分蒸发，同时抑制蛋壳表面微生物滋生。在孵化后期，蛋壳角质层逐渐消失，外表面裂隙增大，有利于气体交换。

3.2 喷醋处理对蛋壳结构的影响

胆绿素是一种强抗氧化剂，产绿壳蛋的母鸡通过在蛋壳中沉积胆绿素去除了循环中的抗氧化剂，从而具有更高的控制自由基的能力。Zikic等[10]对不同蛋壳颜色野鸡的肌纤维进行研究，发现绿壳或蓝壳蛋孵出的雏鸡的胸肌细胞直径较小，肌肉力量弱于褐壳蛋雏鸡。Kozuszek等[11]研究表明，随着储存时间的增加，种蛋的囊胚细胞数不断减少，绿壳蛋的减少数显著高于褐壳蛋。这些情况均可能是导致绿壳种蛋孵化出雏率低于褐壳蛋的原因。醋酸与蛋壳的碳酸钙成分发生化学反应后，会形成结构相对疏松的醋酸钙，这是喷醋处理降低蛋壳强度、提高出雏率的出发点。本次研究结果表明，醋酸喷洒后蛋壳外表面有明显变化，反应产物堆积在蛋壳表面，虽然蛋壳厚度等与常规孵化差异不显著，但孵化率有所提高。已有研究指出，用弱酸处理蛋壳表层可增加蛋壳的导电率，增强水蒸气和CO2在壳体的移动，并改变蛋白的pH值，从而影响鸡蛋的孵化率[12]。Shafey等[13]在孵化前将29周龄母鸡所产种蛋浸泡在酸性维生素C溶液2 min，结果显示维生素C处理提高了种蛋导电率，并显著提高了种蛋的孵化率。因此，喷醋处理对于提高绿壳鸡蛋的孵化出雏率应该起到了实际效用。本次试验各处理差异并不显著，可能与醋酸浓度、处理次数、持续时间、种蛋数量等有关，还需通过深化研究进行验证。