陈国，许秀琴

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315101)

病毒感染威胁人类和动物健康。养殖户为避免病毒感染引发畜禽死亡而造成经济损失，就将金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍、阿昔洛韦、咪喹莫特、美金刚等抗病毒类药物掺入饲料中[1-3]。但是，将人类药物移植兽用，会造成动物中毒、药物残留、病毒抑制或变异等不良反应，同时畜禽体内不同程度的药物残留也会随食物链迁移而影响人类身体健康。因此，开展禽肉中抗病毒药物多残留的液相色谱串联质谱方法研究，建立准确性好、灵敏度高、快捷简便的检测方法尤为重要[4-9]。为此，特开展试验研究，并总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

主要仪器包括：Waters 2695 XevoTMTQ MS液相色谱串联质谱联用仪(美国Waters)，Quintix 124电子天平(德国Sartorius)，N-EVAP 112氮吹仪(美国Organomation)，3K15离心机(德国Sigma)，Vortex Genius 3漩涡振荡器(德国IKA)。

主要试剂包括乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、甲酸(色谱纯)，均购于美国Merck公司。

供试药物标准品包括金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛韦、咪喹莫特、吗啉胍、美金刚、利巴韦林，均购于德国Dr公司。

标准储备液制备：精密称取10 mg标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释成100 μg·mL-1溶液，-18 ℃冰箱中避光保存。

样品制备：取鸡肉样品进行匀浆，充分混匀，制样过程中，尽可能防止样品受到污染或残留物含量的变化，试样于-18 ℃冰箱中保存。

1.2 样品提取与净化

1.2.1 提取

称取5 g试样(精确至0.000 1 g)置于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈-1%(体积分数)甲酸溶液(体积比9∶1)，加盖后超声提取10 min，再旋涡混匀3 min，低温条件下9 000 r·min-1离心10 min，取出上清液，再加入10 mL乙腈-1%甲酸溶液提取液，重复上述步骤，离心后合并上清液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

1.2.2 净化

准确移取5 mL上清液，加入100 mg PSA(乙二胺基-N-丙基)和100 mg C18-ODS(十八烷基-硅胶)，涡旋1 min，5 000 r·min-1离心5 min，移取3.0 mL上清液于10 mL离心管中，在40 ℃条件下用氮吹仪吹至近干，然后准确加入1 mL 0.1%(体积分数)甲酸溶液复溶，涡旋1 min，超声5 min后过膜，试液供液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定。

1.3 基质效应试验

用1.2节处理后的样品基质溶液将金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、阿昔洛韦、咪喹莫特、吗啉胍配制成1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100 μg·L-1的系列基质标准工作液，将利巴韦林配制成5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、100 μg·L-1的系列基质标准工作液。同时，用溶剂按前述质量浓度配制系列标准工作液，以系列基质标准工作液和系列标准工作液的曲线斜率比来评价基质效益。

1.4 试验条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq反相色谱柱，规格100 mm×3.0 mm，粒径1.8 μm。流动相：A相为0.1%(体积分数)甲酸溶液，B相为甲醇。梯度淋洗，流速0.3 mL·min-1，进样体积10 μL。程序如下：0 min，流动相A 99%(体积分数，下同)，流动相B 1%；2.5 min，流动相A 99%，流动相B 1%；4.0 min，流动相A 85%，流动相B 15%；7.0 min，流动相A 10%，流动相B 90%；7.1 min，流动相A 99%，流动相B 1%；10.0 min，流动相A 99%，流动相B 1%。

1.4.2 质谱条件

离子源，电喷雾正离子模式(ESI+)；监测模式，多离子反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)，3 700 V；离子源温度(TEM)，500 ℃；锥孔反吹气流量，25 L·h-1；脱溶剂气流量，1 000 L·h-1。

供试药物的质谱参数如下。金刚烷胺，保留时间7.91 min，定性离子对152.0/92.7(m/z，下同)，定量离子对152.0/135.1，驻留时间100 min，锥孔电压32 V，碰撞电压26 V(定性)、14 V(定量)；金刚乙胺，保留时间8.57 min，定性离子对180.1/121.2，定量离子对180.1/163.3，驻留时间100 min，锥孔电压32 V，碰撞电压24 V(定性)、15 V(定量)；美金刚，保留时间8.75 min，定性离子对180.1/106.7，定量离子对180.1/163.3，驻留时间100 min，锥孔电压32 V，碰撞电压24 V(定性)、15 V(定量)；阿昔洛韦，保留时间7.10 min，定性离子对226.0/134.7，定量离子对226.0/151.8，驻留时间100 min，锥孔电压16 V，碰撞电压26 V(定性)、10 V(定量)；咪喹莫特，保留时间8.60 min，定性离子对241.1/113.7，定量离子对241.1/184.9，驻留时间100 min，锥孔电压66 V，碰撞电压54 V(定性)、22 V(定量)；吗啉胍，保留时间2.68 min，定性离子对172.0/112.7，定量离子对172.0/59.6，驻留时间100 min，锥孔电压28 V，碰撞电压16 V(定性)、18 V(定量)；利巴韦林，保留时间2.97 min，定性离子对245.0/95.6，定量离子对245.0/112.6，驻留时间100 min，锥孔电压18 V，碰撞电压28 V(定性)、8 V(定量)。

2 结果与分析

2.1 基质效应

通过基质效应试验，分别拟合7种抗病毒药物系列基质标准工作液和系列标准工作液的标准曲线(表1)，其决定系数(R2)均大于0.999。金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、咪喹莫特、利巴韦林的基质标准曲线(即由系列基质标准工作液拟合的标准曲线)和溶剂标准曲线(即由系列标准工作液拟合的标准曲线)的斜率比在0.85～0.91，说明基质效应不明显；而阿昔洛韦、吗啉胍的基质标准曲线和溶剂标准曲线斜率比分别为0.63、0.45，基质效应明显。基于此，本试验实际分析样品时均采用基质标准曲线进行定量分析。

表1 供试药物的标准曲线

2.2 检测限、定量限

开展空白样品平行试验，按3倍信噪比计算方法检出限，按10倍信噪比计算方法定量限(表2)。结果显示，7种抗病毒药物的检出限在2.5×10-4～1.5×10-3mg·kg-1，定量限在0.001～0.005 mg·kg-1。

2.3 准确度和精密度

表2 供试药物的定量限和检出限

方法的准确度和精密度分别由添加回收率和变异系数来表示。在鸡肉中按要求添加7种供试药物，每种浓度重复测定6次，计算添加回收率和变异系数，评价方法的准确度和精密度，结果如表3所示。金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、阿昔洛韦、咪喹莫特、吗啉胍在1.0、5.0、50.0 μg·kg-1的添加水平下，添加回收率在79%～107%；利巴韦林在5.0、10.0、50.0 μg·kg-1的添加水平下，回收率在84%～99%。供试药物的平行试验组内和组间变异系数均未超过10%。以上结果表明，该方法具有较好的准确度和精密度。

表3 供试药物的添加回收率和变异系数(n=6)

2.4 样品验证

采用所建立的方法对10个鸡肉样品进行分析，共检出阳性样品3个，均系从样品中检出金刚烷胺，含量分别为0.021、0.025、0.031 mg·kg-1，其他供试药物在各样品中均未检出。

3 小结与讨论

3.1 讨论

3.1.1 提取条件优化

7种供试药物均属于极性化合物，易溶于水和一些有机溶剂，一般选用有机溶剂-水的混合液进行提取。对比乙腈-水溶液(体积比9∶1)和甲醇-水溶液(体积比9∶1)对目标分析物回收率的影响，发现乙腈-水溶液的提取效果更好。向乙腈-水溶液中添加一定比例的甲酸，对回收率的影响不大，但可起到一定的净化效果，能够提高方法灵敏度。因此，综合选择乙腈-1%甲酸溶液(体积比9∶1)作为提取液。

3.1.2 净化方式选择

QuEChERS方法是由分散固相萃取法演变而来的，样品经有机溶剂提取、盐析分层后，再进行分散固相萃取，从而达到净化目的。本研究采用的PSA和C18-ODS填料，对样品中的脂肪、蛋白质净化效果良好，能有效降低基质效应，提高样品检测灵敏度。QuEChERS方法相较于固相萃取小柱的净化方式，更快捷、环保，且成本低廉，有广阔的应用前景。

3.1.3 色谱条件优化

色谱中常用的有机相有甲醇和乙腈。对比发现，若以甲醇作为有机相，7种供试药物的响应值均有较大提高。另外，向水相中添加甲酸或乙酸铵也能提高目标化合物的响应值，但是当添加乙酸铵时，金刚乙胺和美金刚的峰形很难分开，而添加0.1%甲酸时，各供试药物能有效分离，且峰形好。因此，水相采用0.1%甲酸水溶液。

3.2 小结

本方法选择乙腈-1%甲酸溶液(体积比9∶1)作为提取液，采用QuEChERS方法，建立起LC-MS/MS分析方法，金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、阿昔洛韦、咪喹莫特、吗啉胍、利巴韦林的检出限在2.5×10-4～1.5×10-3mg·kg-1，定量限在0.001～0.005 mg·kg-1，回收率在79%～107%，平行试验组内和组间变异系数均未超过10%。可见，所建立的方法适用于禽肉中抗病毒药物的多残留分析。