毛荣良，李英迪，曹艳，黄良水，夏其乐*

(1.常山县豪锋农业发展有限公司，浙江 常山 324207； 2.浙江省农业科学院食品科学研究所 农业农村部果品采后处理重点实验室浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310021； 3.常山县天乐食用菌研究所，浙江 常山 324200)

猴头菇又称猴头蘑、猴头菌、刺猬菌或花菜菌等，属齿菌科猴头属[1]，其营养丰富，味道鲜美，是一种药食两用食用菌，素有“山珍猴头，海味燕窝”之说[2]。猴头菇性平、味甘，活性成分主要有多肽类、多糖类、多酚类、萜类、甾醇类等，具有益精补虚、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、提高免疫力等功效，其子实体可以用来治疗胃溃疡，慢性胃炎和其他、消化道相关疾病[3-5]。关于猴头菇活性成分的研究中，多糖的研究颇多[6]，其他活性物质研究相对较少。酚类物质是主要存在于植物中的次生代谢产物[7]，猴头菇中酚类物质大多以活性酚羟基的形式存在，具有较强的抗氧化活性，可以作为天然的抗氧化剂，也可以经过提取富集后进一步发挥其活性。采用乙醇溶液提取猴头菇中醇溶性小分子成分，如多酚、黄酮等的研究相对较少[8]。本研究以猴头菇为原料，利用响应面法优化猴头菇多酚提取工艺，为获得高品质的猴头菇酚类提取物及下游抗氧化产品的开发提供可靠的手段和一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

猴头菇，采自常山县森力家庭农场；没食子酸标准品，购自上海源叶；福林酚，上海蓝季；乙醇为分析纯。

紫外/可见分光光度仪UV-1800，日本岛津公司；飞鸽低速大容量离心机LXJ-HB，上海安亭科学仪器厂；多功能粉碎机BJ-300，德清拜杰电器有限公司。

1.2 原料预处理

将猴头菇干制品粉碎机粉碎，密封后置于4 ℃冷藏，备用。

1.3 猴头菇多酚含量测定

1.3.1 标准曲线的绘制

多酚含量采用Folin-Ciocalteu法进行测定[9]。分别吸取0.1 mg·mL-1没食子酸标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，置于25 mL比色管中，加入2.5 mL福林酚显色剂，混匀后加入5 mL 5% Na2CO3溶液，加水定容至25 mL，25 ℃下避光反应1 h，于750 nm处测定吸光度。以没食子酸标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制多酚含量标准曲线，并得线性回归方程。

1.3.2 多酚提取液的制备

在前期预试验的基础上，为优化提取工艺，选择不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30 g∶mL)、乙醇浓度(40%、60%、80%)、提取温度(40、60、80 ℃)进行提取工艺的优化。所得提取液4 000 r·min-1，离心10 min，收集上清液，即猴头菇多酚提取液。

1.3.3 多酚得率的测定

取0.3 mL提取液，加9 mL蒸馏水混匀，加入2.5 mL福林酚显色剂，其余试验操作同标准品测定，于750 nm处测定吸光值，根据标曲方程计算样品多酚含量。计算多酚得率：

M=100CNV/m。

式中，M为猴头菇多酚得率(mg·g-1)；C为没食子酸浓度(mg·mL-1)；V为提取液的总体积(mL)；N为稀释倍数；m为猴头菇质量(g)。

1.3.4 响应面法优化猴头菇多酚的提取工艺

采用Design Expert 10.0.3软件进行三因素三水平试验，确定超声辅助提取猴头菇多酚的最佳工艺参数，中心组合试验因素和水平分别为乙醇浓度为40%、60%、80%，温度为40 ℃、60 ℃、80 ℃，料液比为1∶10、1∶20、1∶30 (g∶mL)。

1.4 数据分析

平行试验3次，结果以均值±标准差(means±SD)表示。使用Excel 2007绘图，采用Design expert 10.0.3软件得到响应面图。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据1.3.1标曲测定方法，分别以没食子酸标准品质量浓度为横坐标，750 nm处吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=0.088 8X-0.001 9，R2=0.999 6。结果表明，多酚含量在0～7 mg·L-1范围内线性关系良好。

2.2 响应面优化条件

2.2.1 响应面设计结果分析

为确定最优条件，探究各因素之间的相互作用，通过Box-Behnken法设计试验[10]，以多酚得率为响应值，采用响应面法对猴头菇干制品的酚类化合物进行提取工艺的优化。与传统的多因素单变量优化试验相比，响应曲面法可以研究各因素之间的相互作用，具有试验次数少、省时省力、精确等优点[11]。

对表1试验数据进行回归拟合，得到多酚得率的二次多项回归模型为：

其中，Y为多酚得率的预测响应值，X1为乙醇浓度(%)的编码值，X2为温度(℃)的编码值，X3为料液比(g∶mL)的编码值。

表1 猴头菇酚类提取试验设计与试验结果

2.2.2 响应面模型建立及显著性分析

表2 酚类化合物提取回归模型方差分析

2.3 酚类化合物提取工艺的响应曲面分析、最佳工艺参数确定

图1、2、3显示了不同试验因素(乙醇浓度、温度以及液料比)对于猴头菇酚类化合物提取的影响。从图可以看出，响应值Y随试验因素变化均先增高而后降低，在试验水平范围内出现一个最高点，即为多酚得率较高点。由Design expert 10.0.3软件分析结果可知，猴头菇酚类化合物超声波辅助提取的最佳工艺参数为乙醇浓度60.38%，温度55.46 ℃，料液比1∶15.59(g∶mL)。工艺参数预测的多酚得率为16.799 mg·g-1。为了操作方便，将最佳工艺参数设定为乙醇浓度60%，温度55 ℃，料液比1∶15(g∶mL)。为检验响应面分析法可靠性，3次重复试验的提取得率为16.701 mg·g-1，与预测值较为接近，表明该模型对猴头菇酚类化合物的提取工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

图1 提取温度与料液比对猴头菇多酚得率影响的响应曲面图和等高线图

图2 乙醇浓度与料液比对猴头菇多酚得率影响的响应曲面图和等高线图

图3 乙醇浓度与提取温度对猴头菇多酚得率影响的响应曲面图和等高线图

3 小结

本研究通过乙醇浓度、提取温度、料液比3个影响因素对猴头菇多酚的提取进行研究，通过Box-Behnken试验设计，最终确定最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%，温度55 ℃，料液比1∶15 (g∶mL)，在此条件下，多酚得率相对较高。验证试验显示，猴头菇多酚得率为16.701 mg·g-1，与预测值接近，说明响应曲面法建立的模型准确可靠，能合理优化猴头菇多酚的提取工艺。