白俊慧，柳爱春，何欣

(杭州市农业科学研究院 实验中心，浙江 杭州 310024)

氟虫腈(Fipronil)，是一种广谱杀虫剂，通过作用于α-氨基丁酸受体(GABA)阻断昆虫的神经膜氯离子通道，从而实现杀灭跳蚤、螨、虱等害虫的目的。鉴于其针对性好的特点，氟虫腈曾在全球范围内被广泛运用[1]。2017年，由于某养鸡场工人使用了混有氟虫腈的消毒液而引发的“毒鸡蛋”事件，在欧洲引起了一场食品安全危机[2]。随着氟虫腈毒理研究的深入，研究人员发现，氟虫腈在进入小鼠体内后会迅速发生代谢反应并散布体内各组织，尤其是在皮下脂肪组织和毛囊中会发生明显的富集效应，即使是在用药1周之后，小鼠体内仍会检测到较高浓度的氟虫腈及其代谢物残留[3]。Lyons[4]发现，施用了氟虫腈的小鼠，甲状腺细胞会显著增多，并最终导致肿瘤的生成。这意味着，对人类而言，氟虫腈存在较高的致癌风险。“毒鸡蛋”事件后，欧盟等针对蛋类中氟虫腈的最大残留量作了明确规定，但我国GB 2763—2016《食品安全国家标准》食品中农药最大残留限量中仍未规定蛋类中的氟虫腈最大残留量。

鸡蛋作为价美质优的蛋白质来源，是我国城乡居民饮食结构的重要组成部分[5]。鸡蛋分为蛋黄和蛋清2个部分：蛋清由水、蛋白质、少量的碳水化合物和微量的脂肪构成；而蛋黄中则含有大量的脂肪、蛋白质，以及少量的碳水化合物[6]。本研究拟利用液相色谱-质谱联用法实现对鸡蛋中氟虫腈及其代谢物的快速、高效检测，并研究氟虫腈及其代谢物在蛋黄与蛋清中的分布特点，现总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters Xevo TQ-S液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)；METTLER电子天平，感量0.01 g和0.000 1 g；Eppendorf 5810台式离心机；IKA磁力搅拌器和漩涡混匀器；IKA T18 Basic型高速组织匀浆机；Thermo 10～100 μL、100～1 000 μL、1～5 mL移液器。

氟虫腈粉末(源叶生物，纯度≥98%)；氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜标准溶液(农业农村部环境保护科研监测所，1 000 μg·mL-1)；乙腈、甲醇、乙酸铵均为色谱纯，购于Fisher Chemical公司；甲酸，色谱纯，购于ROE Scientific公司；无水硫酸镁、无水硫酸钠、氯化钠为分析纯，购于中国医药集团。

0.22 μm微孔有机滤膜，固相萃取小柱，购于Waters公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶(PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)，购自上海安谱实验科技股份有限公司；实验室用水为超纯水。

1.2 样品制备与前处理

选取健康产蛋期母鸡30只，将鸡分成2组，每组15只。通过饮水的方式使鸡摄入氟虫腈。试验组每只鸡按15 mg·kg-1(以体重计)的标准喂服锐劲特(氟虫腈)溶液，连喂3 d；空白组鸡正常饮水。空白组与试验组每天的饮水量保持一致。从喂药当天开始采集试验组与空白组鸡所产鸡蛋，收集好的鸡蛋拿回实验室待测，总计收集鸡蛋的时间持续(3+21)d。

取鸡蛋样品，分离蛋清和蛋黄，分别置于50 mL离心管中，混匀，分别称取混匀后的蛋清和蛋黄样品各5 g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，参照GB 23200.115—2018《食品安全国家标准 鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》，分别对蛋黄和蛋清进行提取和净化，取上清液过0.22 μm滤膜，以待测定。

1.3 标准溶液配置

分别准确移取1.0 mL氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜标准溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至100 mg·kg-1作为标准储备液，置于-20 ℃冰箱中保存。配置标准溶液时，移取标准储备液，用50%的甲醇-水溶液逐级稀释，分别配置成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的混合标准溶液。

1.4 色/质谱条件优化

1.4.1 质谱条件

采用直接注射方式进样，对氟虫腈及其代谢物的混合标准溶液(1.0 μg·mL-1)进行质谱采集，同时利用控制变量法对保留时间、定量离子对、碰撞能量、定性离子对等参数进行优化。

1.4.2 色谱条件

参照GB 23200.115—2018，选取C18作为色谱柱，乙酸铵-甲酸溶液作为流动相A，甲醇作为流动相B。洗脱程序：0～3.0 min，流动相A体积分数40%～30%，流动相B体积分数60%～70%；3.0～3.5 min，流动相A体积分数30%～2%，流动相B体积分数70%～98%；3.5～4.5 min，流动相A体积分数2%，流动相B体积分数98%；4.5～6.0 min，流动相A体积分数2%～40%，流动相B体积分数98%～60%。试验中对流动相条件和洗脱时间梯度进行优化。

1.5 前处理方法优化

通过考查图谱和回收率的方式比较QuEChERS方法(组成成分为PSA/C18)和固相萃取法(SPE)对蛋黄和蛋清中氟虫腈及其代谢物的净化效果。

2 结果与分析

2.1 质谱检测参数确定

采用直接注射方式进样，对氟虫腈及其3种代谢物进行信号采集，质谱参数如表1所示。

表1 氟虫腈及其代谢物的质谱参数

2.2 色谱条件优化

试验选用C18为色谱柱，在洗脱时发现，当有机相体积分数为98%时已实现了完全洗脱，因此将洗脱梯度程序修改如下：0～2.0 min，流动相A体积分数40%～30%，流动相B体积分数60%～70%；2.0～2.2 min，流动相A体积分数30%～2%，流动相B体积分数70%～98%；2.2～2.7 min，流动相A体积分数2%，流动相B体积分数98%；2.7～4.5 min，流动相A体积分数2%～40%，流动相B体积分数98%～60%。4种分析物的UPLC-MS/MS色谱图如图1所示，各目标物均得到较好的保留和分离。

2.3 净化效果评价

选取空白样本作为基质加标，分别向蛋清和蛋黄中加入2、5、10 mg·kg-1的氟虫腈及其代谢物混标，经提取、净化步骤后上机检测。依据标准，使用QuEChERS法对蛋黄和蛋清提取物分别进行净化，其中，QuEChERS方法净化剂的配比为50 mg PSA、50 mg C18和150 mg无水硫酸镁。试验发现：QuEChERS方法净化时，蛋清中氟虫腈及其代谢物的加标回收率在90.0%～110.6%，相对标准偏差为0.4%～5.8%；而蛋黄中由于含有大量的脂肪和蛋白质，在使用QuEChERS法进行净化后，仍受到较强的基质效应干扰，回收率仅在60%～85%。采用SPE净化时，蛋清中氟虫腈及其代谢物的加标回收率在94.3%～107.7%，相对标准偏差为0.7%～5.2%；蛋黄中氟虫腈及其代谢物的加标回收率则大幅提高至90.0%～106.5%，相对标准偏差在1.0%～6.1%。出于成本和效率的综合考虑，最终试验中，蛋清使用QuEChERS方法净化，蛋黄使用SPE净化。

图1 优化后的4种待测物液相色谱

2.4 蛋清与蛋黄中氟虫腈及其代谢物的分析

应用所建立的方法对采集的鸡蛋样品进行检测，发现鸡蛋中检测到的药物残留量最高的为氟虫腈砜，此外，氟虫腈在鸡蛋中也有较高检出浓度。本试验中，氟虫腈药物进入鸡体后，鸡蛋中检测到的主要物质为氟虫腈的代谢残留物氟虫腈砜和氟虫腈，以及少量的氟甲腈。用药的第2天，蛋黄与蛋清中开始检测到氟虫腈砜和氟虫腈；用药的第3天，蛋黄与蛋清中出现了氟甲腈残留。氟虫腈进入鸡体后，药物残留的浓度会呈现出一个显著升高后逐渐降低的特征。蛋清中，氟甲腈、氟虫腈和氟虫腈砜的浓度分别在用药后的第9天、第4天、第9天左右达到最大值，之后逐渐降低；蛋黄中，氟甲腈、氟虫腈和氟虫腈砜的浓度分别在用药后的第12天、第8天、第9天左右达到最大值，之后逐渐降低。其中，氟虫腈和氟虫腈砜残留在蛋黄中的浓度为蛋清中的3倍。在停药3周后，鸡蛋中仍有氟虫腈和氟虫腈砜的残留检出。

3 小结

本研究以氟虫腈为研究对象，改进检测和净化方法，分别对蛋黄、蛋清中的氟虫腈及其代谢残留物进行检测分析，结果显示，基于液相色谱-质谱联用可实现对鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的快速、准确、高灵敏度筛查，其中，蛋清宜使用QuEChERS方法净化，而蛋黄宜使用SPE净化。同时，利用建立的检测方法，探索了氟虫腈在鸡蛋内的代谢规律。向鸡连续饲喂15 mg·kg-1(以体重计)的氟虫腈溶液3 d，鸡蛋中检测到的药物残留量最高的为氟虫腈的代谢残留物氟虫腈砜，其次为氟虫腈，以及少量的氟甲腈。用药的第2天，蛋黄与蛋清中开始检测到氟虫腈砜和氟虫腈；用药的第3天，蛋黄与蛋清出现氟甲腈残留，停药3周后，鸡蛋中仍有氟虫腈和氟虫腈砜的残留检出。试验结果对今后深入开展鸡蛋中氟虫腈及其代谢物的摄入风险评估具有指导意义，同时还可为进一步探究鸡体内氟虫腈的代谢转换规律提供数据支撑。