潘波,姜蕾,王冰洁,林勇

(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物病虫害综合治理重点实验室,海南 海口 571101)

草甘膦(glyphosate)是一种高效、低毒、广谱、内吸传导型广谱灭生性除草剂,对多年生深根性杂草地下组织有很强的破坏能力,在抑制农地杂草、保护农作物生长方面发挥了巨大的作用,是我国乃至世界生产量和使用量最大的除草剂[1-2]。随着草甘膦的大量使用,较多草甘膦进入土壤和水中,土壤中的草甘膦虽然易与土壤中的胶体等颗粒物结合[3],但是由于草甘膦与磷酸盐具有相似的吸附机制[4],在土壤吸附位点相互竞争[5],在磷肥使用饱和的地区,进入土壤的草甘膦易发生解吸,再加上草甘膦具有较高的水溶性以及在环境中有较长的半衰期(从几周到几年不等,平均为2个月),使草甘膦在施药较长时间后或者在远离施药点的地方均能检测到[6-7]。大量报道显示,草甘膦及其主要代谢产物氨甲基膦酸(aminomethyl phosphonic acid,AMPA)在农业土壤、沉积物及水体中均经常检出[8-9],其对生态环境和人体健康具有潜在危害[10-11],对人体、动物和微生物均有一定的毒性[12-14]。因此,建立一种快速准确检测水中草甘膦及其降解产物方法,实现水体污染的及时监测和快速应对,以避免水体污染进一步通过食物链传递造成人类健康和生态环境的危害十分必要。不衍生直接进样法操作简便、省时、高效,可满足环境水样检测、监测的需求,然而,目前关于水样中草甘膦及氨甲基膦酸的直接进样法均采用正相色谱法[15],不适合杂质较多的环境水样,而基于柱效高、分离能力强且溶剂选择性更广的反相色谱柱的不衍生直接进样法更具有实际意义。

由于草甘膦和氨甲基膦酸较难挥发,能溶于水,不含发色和荧光官能团,其提取、浓缩、检测难度比较大。同时,2种物质都具有强极性又导致其很难在一般的C18色谱柱上进行分离和保留,进一步增加了检测难度。所以,目前在多种基质包括水体[16]、土壤[17]、茶叶[18-19]等植物源食品[20]和动物源食品[21]中草甘膦和氨甲基膦酸的残留检测普遍要先通过柱前衍生再进行检测。行业标准[22]中使用柱前衍生液相色谱荧光检测器检测土壤和沉积物中草甘膦的残留,但此种方法检出限较高。国家标准[23]中使用气相色谱质谱法检测植物性产品中草甘膦的残留,此种方法衍生步骤较为繁琐,且衍生条件难以控制。行业标准[24]中规定使用9-芴基甲基三氯甲烷将草甘膦和氨甲基膦酸衍生后再由液相色谱-质谱联用仪进行检测,该方法是目前最常用的方法,但是,此法需要复杂的衍生步骤,国标中规定要衍生过夜,耗时长,无法满足快速检测、监测的需求。

本研究通过对色谱条件和前处理方法等条件的筛选,建立基于反相色谱法的不衍生直接进样检测水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法。鉴于目前没有针对水样中草甘膦和氨甲基膦酸检测的国家标准,故本研究又对关于其他介质中草甘膦和氨甲基膦酸检测的国家标准中所涉及的柱前衍生-液质联用检测法进行了优化,进而对2种方法进行系统比较,为水环境中草甘膦和氨甲基膦酸的快速、准确检测提供科学支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC I-class型超高效液相色谱;XEVO TQ-MS型三重四极杆串联质谱仪;色谱柱:Waters BEH C18(100 mm×2.1mm,1.7 μm)、Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);固相萃取小柱:C18(500 mg 6cc)、HLB(200 mg 6cc)。以上均购于美国Waters。

甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯,美国Fisher);丙酮、硼酸钠、无水乙酸铵(分析纯,广东化学试剂厂);9-芴基甲基三氯甲烷(99.0%,美国Sigma);草甘膦标准品(98.6%,德国DR);氨甲基膦酸标准品(99.9%,德国DR);试验用水均为超纯水系统制备。

1.2 溶液的配制

草甘膦、氨甲基膦酸标准储备液(1.0 mg·mL-1):分别精确称取50.0 mg(±0.1 mg)的草甘膦、氨甲基膦酸标准品于聚乙烯塑料瓶中,分别加入49.3 g(±0.1 mg)、50.0 g(±0.1 mg)超纯水,加入100 μL盐酸,充分摇匀并使其全部溶解,低于5 ℃保存,有效期为1年。

混合标准溶液的配制(1.0 mg·L-1):分别取10 μL草甘膦、氨甲基膦酸标准储备液于10 mL容量瓶中,并用超纯水定容至刻度线。

系列标准溶液的配制:取适量混合标准溶液用空白水样逐步稀释,得到草甘膦和氨甲基膦酸质量浓度分别为0.5、2、10、50、200 μg·L-1的系列标准溶液,现用现配。

衍生试剂(9-芴基甲基三氯甲烷的丙酮溶液,1.0 g·L-1)的配制:称取100.0 mg 9-芴基甲基三氯甲烷用丙酮溶解并定容至100 mL。

50 g·L-1硼酸钠缓冲溶液的配制:准确称取5.0 g硼酸钠(Na2B4O7·10H2O),用水溶解并定容至100 mL。

1.3 水样预处理

直接进样法:取1 mL样品过0.22 μm水系滤膜后直接进样测定。

柱前衍生法:取1 mL样品于5 mL离心管中,加入200 μL 50 g·L-1硼酸钠缓冲溶液,混匀后加入200 μL衍生试剂,再次混匀,衍生4 h以上,系列标准曲线溶液按以上步骤进行衍生,过0.22 μm水系滤膜,待测。

1.4 仪器的检测条件

1.4.1 直接进样法色谱条件色谱柱:Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱温:室温;进样量:10 μL;流动相A为乙腈,流动相B为16 mmol·L-1的氨水。液相条件见表1。

表1 直接进样法和柱前衍生法梯度洗脱程序

质谱条件:电喷雾离子源(ESI),负离子模式多反应检测模式,离子源温度150 ℃,去溶剂温度为 450 ℃,去溶剂气流量1 000 L·h-1,毛细管电压2.4 kV。质谱多反应检测系统(MRM)参数:草甘膦定量离子对为168.0/80.9,锥孔电压30 V,碰撞电压14 V;定性离子对为168.0/62.9,锥孔电压30 V,碰撞电压11 V。氨甲基膦酸定量离子对为109.9/62.9,锥孔电压30 V,碰撞电压15 V;定性离子对为109.9/79.9,锥孔电压30 V,碰撞电压12 V。

1.4.2 柱前衍生法色谱条件色谱柱:Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱温:室温;进样量:10 μL;流动相A为乙腈,流动相B为10 mmol·L-1乙酸铵(含体积分数0.1%甲酸)的水溶液。液相条件见表1。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI),正离子模式多反应检测模式,离子源温度150 ℃,去溶剂温度为450 ℃,去溶剂气流量1 000 L·h-1,毛细管电压2.4 kV。MRM参数:草甘膦衍生产物定量离子对为392.0/170.1,锥孔电压25 V,碰撞电压12 V;定性离子对为392.0/214.1,锥孔电压25 V,碰撞电压12 V。氨甲基膦酸定量离子对为334.1/179.1,锥孔电压23 V,碰撞电压10 V;定性离子对为334.1/156.0,锥孔电压23 V,碰撞电压10 V。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

直接进样法:根据草甘膦及氨甲基膦酸的分子结构特征,质谱离子源选择负离子电离模式,取1 mg·L-1的草甘膦和氨甲基膦酸的混合标准液,以20 μL·min-1的流速进入质谱,调节质谱的锥孔电压、碰撞电压等参数,找到草甘膦和氨甲基膦酸的特征母离子分别为168.0和109.9。逐渐加大碰撞能量,找到信号强度最好的2个子离子作为定量和定性离子,草甘膦定量和定性离子对分别为168.0/80.9和168.0/62.9,氨甲基膦酸定量和定性离子对分别为109.9/62.9和109.9/79.9。

柱前衍生法:对标准溶液的衍生液进行ESI离子源正模式下全扫描,选择丰度较高的2个离子碎片作为定量和定性离子。草甘膦与氨甲基膦酸衍生产物母离子分别为392.0和334.1,草甘膦的定量和定性子离子对分别为392.0/170.1和392.0/214.1,氨甲基膦酸的定量和定性离子对分别为334.1/179.1和334.1/156.0。比行业标准[24]中规定草甘膦的定量和定性离子对(392.0/88.0和392.0/214.0)与氨甲基膦酸的定量和定性离子对(334.0/179.1和334.0/112.0)灵敏度都高。

2.2 流动相的优化

为了使检测物质有更好的仪器响应和色谱分离效果,对2种检测方法进行流动相的优化。

直接进样法:分别比较乙腈-16 mmol·L-1氨水、乙腈-27 mmol·L-1氨水、乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵、乙腈-水、甲醇-16 mmol·L-1氨水、甲醇-27 mmol·L-1氨水、甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵、甲醇-水共8种流动相的洗脱分离效果。结果(图1)显示:在乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵和甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵2个流动相下,2种检测物质均基本没有信号;流动相甲醇-水也基本没有信号,乙腈-水信号较弱且物质拖尾严重;乙腈-27 mmol·L-1氨水、甲醇-27 mmol·L-1氨水这2个流动相下,2种检测物质响应信号较弱;乙腈-16 mmol·L-1氨水和甲醇-16 mmol·L-1氨水2个流动相的2种物质信号强度最好且峰型对称,考虑到乙腈拥有更强的洗脱能力,能减少分析时间,故选择乙腈-16 mmol·L-1氨水作为直接测定法流动相。使用直接进样法时发现,由于草甘膦及其代谢产物氨甲基膦酸水溶性较强,极性较大且分子质量较小,一般的C18色谱柱很难对其进行保留,本试验选择HSS T3色谱柱,其固定相是能与100%水流动相兼容的C18,增强了其对这2种极性物质的保留。

柱前衍生法:分别比较乙腈-水和乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵2种流动相的洗脱分离效果。结果(图2)显示:2种检测物质的衍生产物在乙腈-水流动相体系下,在色谱柱的保留分离较差,拖尾严重,峰形不好且信号较低。在乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵流动相下,2种衍生产物有比较好的响应信号,而在流动相中加入甲酸能增加离子化效率,故选择乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵(含体积分数0.1%的甲酸)作为柱前衍生法流动相。

2.3 前处理的优化

行业标准[22,24]中前处理是针对土壤、沉积物、食品等比较复杂的基质样品,并不适合水样品的检测,所以对水样品的前处理进行了优化。

2.3.1 固相萃取小柱的选择选择具有代表性的2种小柱进行比较,一种是C18小柱,样品富集在小柱上,然后再进行洗脱;一种是HLB小柱,样品直接通过小柱,杂质吸附小柱中,目标物直接被洗脱。取空白水样加入混合标准溶液使水样中草甘膦和氨甲基膦酸的质量浓度为100 μg·L-1,分别比较直接进样、C18小柱净化和HLB小柱净化3种净化方法的回收率,结果(表2)显示:直接进样法的草甘膦回收率为94.00%(C18)～96.71%(直接进样),氨甲基膦酸回收率为94.95%(HLB)～102.43%(C18);柱前衍生法:草甘膦回收率为95.95%(HLB)～110.31%(直接进样),氨甲基膦酸回收率为96.15%(HLB)～100.43%(直接进样),3种净化方法的回收率均能满足残留检测的要求。直接进样2种物质的回收率相对较高,考虑到节约成本和操作方便,在样品杂质干扰较少的情况下可直接进样,效率更高;样品杂质较多时,可采用固相萃取去除杂质,HLB小柱较C18小柱省去了洗脱的步骤,且更省时。我们建立的不衍生直接进样法既不需要复杂的前处理,又不需要长时间的衍生步骤,再加上所使用的超高效液相系统,提高了分析效率。使用CAX阳离子交换柱[24],其净化步骤更为繁琐,且价格较高。柱前衍生法需要向样品中引入高浓度的衍生试剂。有文献报道[25]使用柱前衍生-荧光检测器检测时,会出现信号很强的衍生试剂峰,但对样品峰并没有显著影响,可能会对色谱柱寿命及质谱系统产生一定影响。有研究[26-27]显示衍生后过C18小柱净化,能有效去除衍生试剂,改善了峰形,减少衍生试剂对色谱系统的损害。

表2 不同净化方式对水中草甘膦和AMPA回收率的影响

2.3.2 滤膜的选择由于柱前衍生法向样品加入的衍生试剂含有丙酮,故比较水系和有机系2种滤膜对回收率的影响。由表3可知:2种物质通过2种滤膜的回收率无显著差异,可能由于有机溶剂含量较低,对水系滤膜影响较小。由于水比较难浸润有机系滤膜,且水系滤膜相对经济,所以选择水系滤膜。

表3 不同滤膜对水中草甘膦和AMPA回收率的影响

2.4 标准曲线与最低检出限

取1.2节中系列浓度的标准溶液,经0.22 μm水系滤膜过滤后直接进样测定;柱前衍生法按1.3节中方法衍生后经0.22 μm水系滤膜过滤后测定,色谱图见图3和图4。以峰面积(y)对标准溶液浓度(x)绘制标准曲线,并计算线性方程和相关系数,按3倍信噪比作为方法的检出限,以10倍信噪比作为方法的定量限。结果(表4)显示:直接进样法和柱前衍生法检测水中草甘膦和氨甲基膦酸在0.5～200 μg·L-1线性关系均良好,直接进样法草甘膦和氨甲基膦酸检出限分别为0.104和0.072 μg·L-1,定量限分别为0.348和0.241 μg·L-1;柱前衍生法草甘膦和氨甲基膦酸检出限分别为0.019和0.024 μg·L-1,定量限分别为0.063和0.078 μg·L-1。2种方法都能达到残留检测的分析要求,柱前衍生法具有更高的灵敏度,而直接进样法灵敏度稍低,但能够省去复杂的衍生步骤,方便快捷。有研究者使用柱前衍生液相色谱荧光检测器检测草甘膦及氨甲基膦酸[16,25],检出限0.002～0.009 mg·L-1,均高于本文建立的2种方法的检出限。

表4 草甘膦和AMPA的线性方程、相关系数、最低检出限和定量限

2.5 方法的回收率和精密度

2.5.1 方法的回收率在空白水样中进行1、5、10、50、100 μg·L-15个质量浓度的添加回收,每个质量浓度重复3次。结果(表5)显示:直接进样法草甘膦的回收率为90.93%～111.24%,相对标准偏差为2.18%～16.52%,氨甲基膦酸的回收率为81.98%～93.11%,相对标准偏差为2.46%～10.27%。柱前衍生法草甘膦的回收率为86.37%～110.32%,相对标准偏差为0.72%～8.44%,氨甲基膦酸的回收率为85.56%～100.43%,相对标准偏差为0.44%～6.54%。2种方法的回收率均能满足残留检测要求。

表5 直接进样法和柱前衍生法草甘膦和AMPA的回收率

2.5.2 方法的精密度按试验方法对50、100 μg·L-1草甘膦和氨甲基膦酸的混合标准液进行检测,重复测定6次,计算峰面积的相对标准偏差。直接进样法2种物质峰面积相对标准偏差为1.81%～2.27%,柱前衍生法2种物质峰面积相对标准偏差为2.07%～2.58%,表明方法的重复性及稳定性较好,方法能满足农药残留检测的要求。

3 小结

本文建立了更适合环境水样检测的基于反相色谱法的不衍生直接通过液相色谱质谱联用检测水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法,并对柱前衍生后液相色谱质谱联用检测水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法进行了优化,进而对2种方法进行系统的比较。结果表明:2种方法均能满足水中草甘膦和氨甲基膦酸的定量检测要求。柱前衍生法具有更好的灵敏度,但是需要复杂的衍生步骤,且衍生时间需4 h以上。而直接进样法灵敏度稍低,但能够省去衍生步骤,易于操作,方便快捷。所以在对水中残留草甘膦及其降解产物进行检测时,应根据检测需要对方法进行选择。