殷涂童,周倩倩,张静,张亚见,盛下放,何琳燕

(南京农业大学生命科学学院/农业农村部农业环境微生物重点实验室,江苏 南京 210095)

镉(Cd)是蔬菜重金属污染中常见的一种重金属。在Cd污染的土壤中种植蔬菜,蔬菜易受到镉的毒害,引起减产,品质下降,同时也易出现镉超标事件,从而威胁人体健康[1]。调查显示,中国蔬菜Cd超标问题较为严重[2-3]。丁爱芳等[4]发现南京城郊蔬菜样品中Cd、Pb含量都超过国家食品卫生安全标准;师荣光等[5]研究表明天津市郊蔬菜品质受Cd污染;Wang等[6]调查发现湖南省湘江中下游地区48种蔬菜中Cd超标率高达68.8%;李明德等[7]发现长沙市主要蔬菜中50%的叶菜类蔬菜样品Cd超标。因此,探究降低蔬菜可食用组织中Cd含量、修复镉污染土壤的方法极为重要。

近年来,重金属污染土壤钝化解毒修复技术备受关注,其可操作性强,可边生产边修复。在重金属污染土壤中施加某些具有离子吸附特性的钝化剂可实现重金属钝化解毒修复功效[8]。生物炭(biochar)具备多孔的特性,有着良好的亲水性,同时生物炭能够有效提高土壤有机质、土壤pH值,这些都能有效降低土壤中重金属的活性[9],减少蔬菜对重金属的吸收与积累。钾长石是一类储量多、分布广的天然硅铝酸盐矿石,具有特殊的孔隙及一定的离子交换性,在治理环境污染领域存在一定的潜能,尤其是经过改性或者加工的钾长石粉对重金属的吸附能力大大加强[10]。然而,钝化修复剂施用太多可能会产生二次污染,阻碍植物微量元素的吸收,影响土壤的结构和理化性质,这将直接影响钝化修复剂的持续应用[11]。

针对化学钝化修复剂可能存在的问题,生物钝化修复成为研究热点,利用钝化细菌来阻控蔬菜吸收、积累重金属成为许多学者不断探索的方向。细菌表面具有许多官能团,能够与重金属结合,竞争吸附土壤中的重金属。Han等[12]发现SerratialiquefaciensCL-1能够降低溶液中Cd含量70%以上,红外光谱显示多种官能团参与Cd的吸附,该菌株能够分泌一些胞外聚合物、H2S、多胺类物质,从而降低植物根际重金属的有效性。此外,根际微生物还能够分泌植物激素(如IAA、铁载体等),同时还具备溶磷、溶钾、固氮功能,这些作用能够减轻重金属对植物的毒害作用,增加农作物产量,提高农作物品质。关于植物根际促生细菌(PGPR)被应用于生物钝化修复的研究和实践的报道已有许多,如Wang等[13]发现RalstoniaeutrophaQ2-8能减少小麦地上部镉和砷的吸收,并增加小麦根细胞壁组织和生物合成相关蛋白的表达;Li等[14]发现接种内生巨大芽胞杆菌H3可减轻Cd污染对杂交狼尾草的毒性。一些学者开始探究细菌和钝化剂联合使用的成效。贺卓等[15]发现细菌联合海泡石能够显著降低辣椒和茄子果实中铅含量,提高蔬菜品质。Chen等[16]利用NeorhizobiumhuautlenseT1-17 与蛭石或草炭复合,发现相比单一处理,复合处理能够显著降低辣椒果实的铅、镉含量,减少重金属的积累。

本研究采用盆栽试验,以Cd抗性细菌BacillushalotoleransG20与生物炭、钾长石为钝化剂,研究在Cd污染土壤中不同钝化剂对生菜生长、品质、重金属含量以及土壤理化性质的影响,以期明确细菌钝化剂减少蔬菜中重金属含量的效果,阐明其阻控蔬菜吸收重金属机制,为今后受污染农田的修复、蔬菜安全生产提供理论依据和实践经验。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试蔬菜为生菜(LactucasativaL.var.ramosaHort.),品种为‘香港玻璃生菜’,种子购自江苏省农业科学院种子站。供试菌株为本实验室保存的Cd抗性细菌BacillushalotoleransG20(GenBank登录号MH393328),供试钝化剂为生物炭和钾长石粉,购自富华纳米新材料有限公司,使用前经过研磨并过孔径为75 μm的筛。

1.2 钝化剂的制备

供试菌株G20经活化,挑取单菌落接种至新鲜LB培养基(酵母膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、pH7、水1 L),30 ℃、160 r·min-1振荡培养18 h,6 000 r·min-1离心5 min后,收集菌体,用生理盐水重悬(保持总体积不变),细菌数量在108CFU·mL-1以上。将该菌液分为2份,1份为活菌液G20L,另1份菌液经121 ℃、高压灭菌30 min,制备灭菌液G20D。将生物炭(B)和钾长石(K)经121 ℃、高压蒸汽灭菌60 min后,分别与制备的活菌液、灭菌液按质量体积比为1∶1的比例混合,160 r·min-1振荡混合1 h,37 ℃烘干,即分别得到菌剂B(G20L+B)、菌剂K(G20L+K)、灭菌菌剂B(G20D+B)、灭菌菌剂K(G20D+K)。其中活菌菌剂的细菌数量约108CFU·g-1。

1.3 盆栽试验

盆栽试验土壤采集自江苏省南京市栖霞区某矿区周边一处农田(32°9.7′ N,118°56.8′ E)。土壤基本性质为:Cd(2.03±0.26)mg·kg-1,有机质(11.67±1.49)g·kg-1,pH(6.81±0.05),肥力中等偏低。将采集的试验土壤放置于阴凉处风干,去除杂草和石块,锤碎。共设置9个处理:1)未经任何处理的对照(CK);2)每千克土壤加入50 mL菌液的接菌处理(G20L);3)每千克土壤加入50 g生物炭的处理(B);4)每千克土壤加入50 g钾长石的处理(K);5)每千克土壤加入50 g菌剂B的处理(G20L+B);6)每千克土壤加入50 g菌剂K的处理(G20L+K);7)每千克土壤加入50 mL灭菌菌液的处理(G20D);8)每千克土壤加入 50 g 灭菌菌剂B的处理(G20D+B);9)每千克土壤加入50 g灭菌菌剂K的处理(G20D+K)。将各处理土壤和钝化剂拌匀,拌匀后平衡3 d。

根际袋的制备采用Liang等[17]方法并略做改动(根际袋长10 cm,宽5 cm):准确称取20 g拌匀后的各处理组土壤置于根际袋中,随后将根际袋和对应拌匀过的土壤一起装盆,使根际袋埋没于盆钵中,每个盆钵中放置5个根际袋,每个根际袋可移植1棵生菜,盆中土壤和根际袋中土壤总计2 kg。将生菜种子经75%(体积分数)乙醇消毒后,播种于装有营养土的穴盘中,置于光照温室中培养,定期浇水管理,育苗10 d。挑选长势良好一致的生菜幼苗,用10 mL菌液蘸根处理G20L、G20L+B和G20L+K处理生菜幼苗1 h,以使功能菌株能够更好在生菜根部定殖,随后和其他处理组合中的幼苗一起移入相对应盆钵的根际袋中,每盆5棵,定期浇水管理直至收获。生长期内给予充足的光照,保持温室内的温度为18～22 ℃,湿度为50%～70%,生长周期约50 d,期间不施加任何肥料。收获时将生菜从根际袋中连根取出,保留根际袋中的土壤,用毛刷轻轻刷落黏附于根上的土壤,和根际袋中的土壤收集在一起,即为根际土壤。妥善保管生菜样品及土壤样品,用于后续测试。

1.4 土壤和植物样品的分析

1.4.1 生菜生物量将生菜植株清洗干净,根部用0.01 mol·L-1EDTA-2Na溶液浸泡10 min,清洗后沥干,称取生菜的鲜质量。将生菜地上部和根部组织于100 ℃杀青30 min,然后80 ℃烘干至恒质量,称取干质量。

1.4.2 生菜可食用组织Cd含量和根部Cd含量生菜地上部为可食用组织,将烘干后的地上部和根部组织捣碎,准确称取0.2 g于微波消解仪中消解,5% HNO3定容,用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定Cd含量。

1.4.3 生菜Cd转移系数、富集系数及地上部Cd总含量生菜Cd转移系数(translocation factor,TF)、富集系数(bioconcentration factor,BCF)及Cd总含量计算公式为:转移系数=地上部Cd含量/根部Cd含量;富集系数=根部Cd含量/土壤Cd含量;Cd总含量=生菜地上部Cd含量×地上部干质量。

1.4.4 生菜可食用组织营养品质将新鲜的生菜地上部研磨成匀浆,稀释后离心并去除沉淀。上清液中维生素C含量参考刘绍俊等[18]的方法,用钼蓝比色法测定;生菜中亚硝酸盐含量测定采用分光光度法(盐酸萘乙二胺法)测定。每个样品3次重复,每批样品设3个空白对照。计算每100 g新鲜可食用组织中各营养成分的含量。

1.4.5 根际土壤细菌数量准确称取1.000 g新鲜根际土壤,加99 mL无菌去离子水并充分振荡成土壤悬液。土壤悬液经80 ℃处理15 min后,梯度稀释涂布于含有50 mg·L-1壮观霉素的LB平板上。30 ℃培养2 d后计数。

1.4.6 根际土壤有效态Cd含量二乙烯三胺五乙酸(DTPA)提取剂的配制参照Li等[19]的方法。准确称取1.000 g风干后研磨过孔径为75 μm筛的根际土壤,将其与DTPA提取剂按质量体积比为1∶4混合,160 r·min-1室温振荡 2 h,8 000 r·min-1离心后取上清液,用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液中Cd浓度,并计算每千克土壤样品中DTPA提取态Cd含量。

1.4.7 根际土壤pH值将风干并研磨过孔径为75 μm筛的1.000 g根际土壤与去离子水按质量体积比为1∶2.5混合,160 r·min-1室温振荡2 h,6 000 r·min-1离心5 min后,用pH计测定土壤pH值。

1.4.8 根际土壤Cd的分级提取及形态变化使用BCR分级提取法对根际土壤中Cd进行分级提取,每步提取完成后,用去离子水清洗,5 000 r·min-1离心10 min,将上清液与相应的提取液合并,用ICP-OES测定Cd含量。第1步为酸可提取态Cd,第2步为可还原态Cd,第3步为可氧化态Cd。

1.4.9 根际土壤有机质含量采用重铬酸钾容量法[20]测定土壤有机质含量。

1.5 数据处理与分析

各处理均重复3次。采用Microsoft Office 2016和Graphpad Prism软件制表与绘图。采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析,差异显著性采用 ANOVA 单因素方差分析和Duncan’s测验法。

2 结果与分析

2.1 不同钝化剂对生菜干质量和Cd含量的影响

由图1-A可见:在Cd污染土壤中,与CK相比,活菌液G20L处理显著增加生菜地上部干质量(22.5%)(P<0.05),且与生物炭、钾长石分别制成的固体菌剂B(G20L+B)处理和固体菌剂K(G20L+K)处理也能增加生菜地上部干质量,分别增加33.3%和20.9%(P<0.05),而生物炭(B)、钾长石(K)处理、灭菌液及灭菌固体菌剂的促生作用不显著。和灭菌液相比,活菌液对生菜的促生作用增加23.3%(P<0.05)。活菌固体菌剂与灭菌固体菌剂对生菜的促生作用无显著差异。

与CK相比,除K处理外,其他处理生菜地上部Cd含量均显著下降(图1-B)。G20L、G20L+B和G20L+K处理使生菜地上部Cd含量分别显著降低40.6%、53.1%和40.6%,且优于G20D、G20D+B和G20D+K处理,说明活的功能菌株G20发挥了主要作用,死菌体也有部分作用。其中G20L+B处理的生菜地上部Cd含量显著降低53.1%,降至0.15 mg·kg-1,低于国家标准规定的蔬菜Cd含量阈值(0.2 mg·kg-1)。与CK相比,处理组G20L、G20L+B和G20L+K处理生菜地上部Cd总量显著降低30.4%、48.7%和30.9%,而其他处理降低生菜Cd总量的效果无显著差异(图1-C)。此外,与对照组相比,所有处理均能显著降低生菜根部Cd含量,其中G20L+B处理生菜根部Cd含量降低35.8%(图1-D),各处理组间无显著差别。

由此可知,菌液G20L能显著促进生菜生长,减少生菜吸收Cd,且与生物炭制成的固体菌剂能更好发挥协同作用,使生菜生产更安全。

2.2 不同钝化剂对生菜Cd转运系数和富集系数的影响

由表1可知:与CK相比,各处理生菜Cd转运系数无显著差异,但各处理都能显著降低生菜根的Cd富集系数。G20L+B处理生菜根Cd富集系数显著下降48.6%,G20L和G20L+K处理作用效果稍弱,均高于灭菌处理组,可见活菌处理能够有效降低Cd在生菜根部的富集,生物炭与菌株G20的协同作用要好于钾长石与菌株G20的协同作用。

表1 不同钝化剂对生菜Cd转运系数和富集系数的影响

2.3 不同钝化剂对生菜品质的影响

在Cd污染土壤中,与CK相比,除G20D处理外,其他处理均能显著增加生菜地上部维生素C含量,其中G20L+B处理效果最佳,能够使生菜维生素C含量显著增加32.9%,G20L、B、K、G20L+K、G20D+B和G20D+K处理之间生菜维生素C含量无显著差异(图2-A)。

与CK相比,B和K处理对生菜亚硝酸盐含量没有影响,G20D、G20D+B和G20D+K处理生菜亚硝酸盐含量也没显著影响;只有G20L、G20L+B和G20L+K处理显著降低生菜亚硝酸盐含量,其中G20L+B处理生菜亚硝酸盐含量最低,比CK显著降低38.8%(图2-B)。

2.4 不同钝化剂对生菜根际土壤理化性质的影响

由图3可知:与CK相比,除G20D处理外,其他处理均显著降低生菜根际土壤有效态Cd含量,其中G20L+B和G20L+K处理生菜根际土壤有效态Cd含量分别显著降低45.4%和34.4%(P<0.05),优于G20L处理;生物炭B、钾长石K及其灭菌固体菌剂处理生菜根际土壤有效态Cd含量之间无显著差异。添加生物炭能够显著提高生菜根际土壤pH值,且G20L+B与G20D+B处理,都显著提高生菜根际土壤pH值,其他处理没有显著差异。与CK相比,B、G20D+B和G20L+B处理都能够显著增加根际土壤有机质含量,其中G20L+B处理使生菜根际土壤有机质含量显著增加44.6%(P<0.05),其他处理都没有显著作用,说明土壤中有机质的增加主要与生物炭的添加有关,活细胞能提供少量有机质,而钾长石和灭活菌液提供的有机质微乎其微。

2.5 不同钝化剂对生菜根际土壤细菌数量的影响

由图4可知:在Cd污染土壤中,与CK相比,G20L、G20L+B和G20L+K处理的生菜根际土壤细菌数量大于106CFU·g-1,而其他处理没有明显作用,说明菌株G20能够在生菜根际土壤中良好定殖。

2.6 不同钝化剂对生菜根际土壤Cd形态及含量的影响

与CK相比,除G20D处理外,其他处理生菜根际土壤酸可提取态Cd含量都显著降低(图5-A)。G20L、G20L+B和G20L+K处理生菜根际土壤中酸可提取态Cd含量分别显著降低32.0%、48.2%和29.3%。与CK相比,各处理对生菜根际土壤可还原态Cd没有明显影响,仅G20L+B处理生菜根际土壤可还原态Cd含量显著增加40.9%(图5-B)。此外,与CK相比,生物炭及其固体菌剂(B、G20L+B、G20D+B)处理能够使生菜根际土壤可氧化态Cd含量分别显著提高51.5%、93.2%和61.4%,菌株G20处理、钾长石及其固体菌剂没有显著性差异(图5-C),可见土壤中可氧化态Cd含量的提高与生物炭添加有关,而钾长石没有作用。

2.7 生菜地上部Cd含量与根际土壤各项指标的相关性分析

生菜地上部Cd含量与根际土壤pH、细菌数量和有机质含量均负相关,相关系数(r)分别为-0.25、-0.745**和-0.577**;与有效态Cd含量正相关(r=0.855**)。除pH值外,其他3项相关系数都达到极显著水平,说明生菜根际土壤细菌数量增加,有机质含量增加,有效态Cd含量降低,能够促使生菜地上部Cd含量降低。

3 讨论

蔬菜安全生产是重金属污染土壤修复的一个重要目标。Xiong等[21]利用恶臭假单胞菌X4/pIME与生物炭、稻草灰、石灰等复合处理,发现其最佳处理组合生菜地上部Cd含量降低至0.14 mg·kg-1。本研究比较不同钝化剂对生菜吸收Cd的影响,发现生物炭与菌株G20制备的固体菌剂(菌剂B)降低生菜地上部Cd含量的效果最佳,能够使生菜地上部Cd含量降至0.15 mg·kg-1,低于国家蔬菜安全生产限量标准,为生菜安全生产提供了良好的技术材料。

本研究中,处理都能够提高生菜地上部维生素C含量,且G20以及G20固体菌剂能够显著降低生菜亚硝酸盐含量,而生物炭或钾长石的单一处理、灭菌处理对亚硝酸盐含量都没有显著影响。贺卓等[15]也发现PGPR菌株P34和海泡石的复合处理能显著提升辣椒和茄子的可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C含量。Wang等[22]发现利用巨大芽胞杆菌H3可以增加小白菜和上海青维生素C含量和可溶性蛋白含量,提高蔬菜品质。缪凯[23]发现玉米秸秆和反硝化细菌联合使用,能够降低小白菜和甘蓝地上部硝酸盐含量,进而降低亚硝酸盐含量。蔬菜地上部亚硝酸盐含量的改变可能与功能菌株在蔬菜根部的有效定殖有关,同时蔬菜品质提升也反映蔬菜受Cd胁迫的缓解。

土壤中有效态Cd是易于被植物吸收利用的。Suksabye等[24]发现接种枯草芽胞杆菌(B.subtilis)能显著降低Cd污染土壤中水稻Cd积累,减少水稻根际土壤有效态Cd含量。接种芽胞杆菌菌株ZAN-044也显著减少土壤中植物可利用Cd含量[25]。本研究中,不同处理生菜根际土壤酸可提取态Cd含量显著减少,而生物炭固体菌剂处理的土壤可氧化态和可还原态Cd含量显著增加,说明土壤Cd形态发生转变,植物可利用态大幅降低。下一步将通过物理、化学分析方法探究生物炭固体菌剂处理下土壤Cd形态的转变规律。

土壤pH值是影响重金属有效性的一个重要因素,一般与酸可提取态重金属含量呈负相关,而与可氧化态和可还原态重金属呈正相关。可氧化态重金属在土壤中主要表现为有机结合态,可还原态重金属在土壤中主要表现为铁锰氧化态。随土壤pH值的升高,土壤中氧化物、矿物等物质表面的负电荷数量会增加,增大对可交换态重金属的吸附,土壤中存在的有机物重金属络合物会逐渐稳定,有机结合态重金属含量增多,同时pH值的升高还会促使铁锰等阳离子与氢氧根形成沉淀,进而使铁锰氧化态增多[26]。

土壤有机质含量也是影响土壤重金属有效性的重要因素,有机质对于某些不溶性盐类、金属离子和矿物颗粒有延缓沉淀的作用,腐殖质对金属离子具有强烈的表面吸附与离子交换吸附以及螯合作用[27]。细菌胞外分泌物(如EPS等)也能与土壤中重金属发生螯合作用,降低重金属有效性。周涵君等[28]发现使用烟秆制成的生物炭能使土壤pH值和有机质含量均呈升高的趋势。同时,随生物炭施用量的增加,土壤有效态Cd和可交换态Cd含量显著降低,土壤碳酸盐结合态Cd、铁锰氧化物结合态Cd、有机结合态Cd显著上升。Liu等[29]发现在稻田中施加生物炭能够提高土壤pH和有机质含量,并减少水稻对Cd的吸收。本研究中,G20L+B处理能够显著增加根际土壤pH值和有机质含量,生物炭提升pH值和有机质,菌株G20细胞富含有机质和各种胞外分泌物,共同导致Cd向低有效性的形态转变,这可能是该生物炭固体菌剂能够有效降低土壤Cd有效性、减少生菜Cd积累的原因。钾长石虽然具有一定的孔隙和离子交换能力,但对根际土壤pH值和有机质的影响有限,总体效果远不如生物炭;灭菌液及其复合处理中,虽然死亡菌体也能提供营养物质,但数量有限,无法像活菌体一样生长代谢,所以灭菌液及其固体菌剂处理效果均不佳。

综上所述:在中度Cd污染的土壤中,B.halotoleransG20与生物炭制备的固体菌剂(菌剂B)能够显著降低生菜地上部Cd含量和根际土壤有效态Cd含量,提高土壤pH值及有机质含量,降低土壤酸可提取态Cd含量,提高可氧化态Cd和可还原态Cd含量,增加生菜地上部维生素C含量,降低亚硝酸盐含量,在保障Cd污染环境下蔬菜安全生产中具有良好潜力。