杨立昌，吴庆珊，高 阳，陈千权，王玉倩，牛晓娟，翁庆北

(1.贵州师范大学生命科学学院，贵阳 550001； 2.贵州省教育科学院，贵阳 550081)

植物内生菌指其生活史部分或整个阶段生长在健康植物组织或细胞内，并对宿主不引起明显病症的一类微生物[1]，最初于1926年由Perotti等在健康植物根内发现[2]。植物内生菌与宿主之间形成互利共生的关系，并促进宿主生长和发育[3]，在植物微生态系统中具有重要作用[4]。

种子中存在的内生菌有助于宿主植物内生菌的形成[5,6]，种子内生菌是植物内生菌的重要来源之一[7]。研究表明，种子内生菌对水稻和玉米等禾本科植物种子萌发、幼苗生长发育及宿主植物的生长具有重要作用[7-9]。通过高通量测序对6个不同品种玉米种子内生细菌研究表明，不同品种玉米种子中包括了8种共有内生细菌，且与玉米生长呈正相关，推断种子内生细菌可促进玉米的生长发育及对环境的适应性[10]。因此，明确种子内生菌的组成对研究内生菌对种子萌发及植株生长发育的作用具有重要意义。

金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)为兰科(Orchidaceae)珍稀、名贵药用植物，具滋阴润肺、益胃补肾、降火、增强人体免疫力、抗衰老等治疗和保健功效[11]。金钗石斛种子存在后熟现象，且缺乏胚乳组织，需与真菌等微生物共生才能萌发[12]。种子萌发困难也是造成包括金钗石斛在内的兰科植物资源紧张的一个重要因素。目前从金钗石斛根、茎、叶等器官中分离了内生真菌和内生细菌，且表明具内生菌抑菌作用，对植物具促生等作用[3,13-15]，但金钗石斛种子内生菌的结构组成尚未阐明。本研究基于免培养和高通量测序技术研究金钗石斛种子内生菌的多样性，初步阐明金钗石斛种子内生细菌和内生真菌的结构和组成，为今后进一步金钗石斛的高效栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 蒴果采集

金钗石斛蒴果采于贵州省赤水市旺隆镇信天金钗石斛培育基地(北纬28°32′01″，东经105°51′52″，海拔353 m)。

1.2 种子内生菌总DNA的提取

1.2.1表面消毒

将蒴果清洗，晾干，70%乙醇浸泡1 min后，转移至5%次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水清洗3次，以达到表面消毒的目的。

1.2.2内生菌DNA提取

将4.00 g蒴果表面消毒后，蒴果内种子用液氮研磨，悬浮于50 mL酶反应液(1 320 mg CaCl2·2 H2O，88.3 mg KH2PO4，12.75 g甘露醇，1 g 2-N-吗啉乙烷磺酸，10 g纤维素酶，1 g果胶酶，蒸馏水定容到1 L，过滤灭菌)，置28 ℃避光反应7 h后，4 ℃ 1 400 r·min-1离心25 min，上清液5 000 r·min-1离心20 min，所得沉淀用于提取种子内生菌基因组总DNA。参照焦军影[16]的CTAB小量提取法、CTAB法[17]以及采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)等3种方法分别提取。提取的种子内生菌基因组DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，合并DNA并用于测序。

1.3 高通量测序及数据分析

以种子内生菌基因组DNA为模板，分别利用16 S V 4区引物(515 F和806 R)[18]和ITS 1区引物(ITS 5-1737 F和ITS 2-2043 R)[19]对内生细菌和真菌进行PCR扩增。采用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit构建文库，经Qubit和Q-PCR定量检测合格后，HiSeq 2500 PE 250上机测序。高通量测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

基于原始数据(raw data)过滤所得有效数据(clean data)进行OTU聚类和物种分类分析。通过Mothur方法[20]与SILVA的SSUrRNA数据库(http://www.arb-silva.de/)，对OTU代表序列进行物种注释和分析。

1.4 多样性分析

使用Qiime软件(Version 1.7.0)计算Chao 1、香农指数(Shannon diversity inedx)和辛普森指数(Simpson diversity inedx)等，分析在97%一致性阈值下的Alpha多样性指数[20]。

2 结果与分析

2.1 金钗石斛种子内生菌OTU分析

对金钗石斛种子内生细菌测序共获得58 384条高质量的16 S rDNA基因序列(Total Tags)，其中58 271条数据(Taxon Tags)可用于后续构建OTUs并获得注释信息，频数为1且无法被聚类到OTU的序列(Unique Tags)数目为113条。内生细菌共归为13个OTUs(相似性≥97%)(表1)。

内生真菌测序共获得59 932条有效数据，其中用于后续OTUs构建并获得注释信息的有809条，共归为14个OTUs(表1)。有59 017条数据比对注释为金钗石斛植物物种序列，其余106条数据频数为1且无法被聚类到OTU，均不纳入后续分析。

表1 金钗石斛种子内生菌注释情况

2.2 金钗石斛种子内生菌物种分布

2.2.1内生细菌

金钗石斛种子内生细菌隶属于变形菌门(Proteobacteria)和蓝细菌门(Cyanobacteria)，分别占74.49%和25.51%，见图1。

图1 种子内生细菌门水平和属水平丰度分布

变形菌门包括3个纲，5个目，6个科，5个属。α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)占0.87%，包括1个OTU，为立克次氏体目(Rickettsiales)未分类(unidentified mitochondria)细菌。β-变形菌纲(Betaproteobacteria)占0.01%，包括1个OTU，为红环菌目(Rhodocyclales)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)细菌。γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)包括3个目，4个科，4个属，包括8个OTUs，占73.61%：肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌占73.58%，其中泛菌属(Pantoea)占3.38%，有70.20%的肠杆菌科细菌属水平分类未定被划入Others；假单胞菌目(Pseudomonadales)占0.02%，包括假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)和莫拉氏菌科(Moraxellaceae)不动杆菌属(Acinetobacter)，分别占0.01%和0.01%；弧菌目(Vibrionales)、弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)占0.01%。

蓝细菌门包括未分类的unidentified chloroplast，占25.51%，3个OTUs。

2.2.2内生真菌

金钗石斛种子内生真菌隶属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和接合菌门(Zygomycota)，分别占内生真菌的97.04%、2.84%和0.12%(图2)。

图2 种子内生真菌门水平和属水平丰度分布

子囊菌门分属于4个纲，6个目，10个科，5个属。酵母纲(Saccharomycetes)占88.75%，包括1个OTU，为酵母目(Saccharomycetales)、分类未定科(Incertae sedis Saccharomycetales)德巴利酵母属(Debaryomyces)。座囊菌纲(Dothideomycetes)有4个OTUs(1.61%)，格孢腔菌目(Pleosporales)占1.36%，包括格孢菌科(Pleosporaceae)链格孢属(Alternaria)，占0.74%，以及未分类的格孢腔菌目(Incertae sedis Pleosporales)，占0.62%。散囊菌纲(Eurotiomycetes)有2个OTUs(1.24%)，包括散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Trichocomaceae)，占0.99%；以及刺盾炱目(Chaetothyriales)毛蕊科(Herpotrichiellaceae)，0.25%，属水平分类未定。锤舌菌纲(Leotiomycetes)有1个OTU(0.25%)，为柔膜菌目(Helotiales)石竹科(Rutstroemiaceae)蜡盘菌属(Rutstroemia)。另外，子囊菌门真菌在纲水平占5.19%(1个OTU)和属水平占7.29%分类未定划入Others。

担子菌门包括伞菌纲(Agaricomycetes)1个纲，2个目，4个OTUs(2.84%)。其中伞菌目(Agaricales)占2.35%，已鉴定的包括3个科2个属：粉褶菌科(Entolomataceae)粉褶菌属(Entoloma)，占1.12%；鬼伞科(Psathyrellaceae)小脆柄菇属(Psathyrella)占0.74%；小皮伞科(Marasmiaceae)占0.49%，属水平分类未定。糙孢孔目(Trechisporales)水珠花科(Hydnodontaceae)占0.49%，属水平分类未定。

接合菌门仅包括未分类的接合菌门(Incertae sedis Zygomycota)，占0.12%，1个OTU。

2.3 物种多样性分析

在97%一致性阈值下，分析金钗石斛种子内生菌Alpha多样性指数。其中，内生细菌Shannon指数为1.82，Simpson指数为0.69，Chao 1指数为11.00。内生真菌Shannon指数为0.57，Simpson指数为0.79，Chao 1指数为14.13(表2)。

表2 金钗石斛种子内生菌Alpha多样性指数

3 讨 论

尽管植物微生物群落对植物的健康至关重要，但对种子微生物群落的作用了解较少。本研究利用免培养技术和高通量测序分析了兰科植物金钗石斛种子内生菌的多样性，结果表明，内生细菌包括了13个OTUs，泛菌属为优势属。内生细菌香农指数和辛普森指数分别为1.82和0.69，Chao 1指数为11.00。内生真菌含14个OTUs，德巴利酵母属为优势属。内生真菌香农指数和辛普森指数分别为0.57和0.79，Chao 1指数为14.13。此研究为今后从种子内生菌的角度进一步指导金钗石斛的种子萌发及幼苗栽培具有一定意义。

本研究通过高通量测序表明，金钗石斛种子共包括13种内生细菌，包括变形菌门(74.49%)的5个属和蓝细菌门(25.51%)。其中，泛菌属、假单胞菌属、不动杆菌属等金钗石斛内生细菌被普遍报道存在于植物种子中，为种子内生细菌优势类群[10,21-23]。与已报到的水稻、玉米、小麦和油菜等种子中内生细菌相比，本研究的金钗石斛未注释到放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)等内生细菌类群[7,9,21]。由于不同种子的内生菌对宿主具有选择专一性[24]。植物分泌物类型以及微生物在植物组织中定殖、存活并传播给种子的能力不同，不同植物种子内生菌存在差异[25]。尽管课题组先前从金钗石斛根、茎和叶及根际土壤中分离到变形菌门、厚壁菌门和放线菌门等内生细菌[13,14]，但本研究在金钗石斛种子中未检测到这些类群的微生物。种子内生菌可能来自不同植物器官或分生组织，通过微管连接或配子，转移、定殖于种子胚芽和胚乳[26]，并垂直传播[25,27,28]。但由于种子是受植物高度保护的封闭性器官，其内生菌的种类和数量较其他器官少[29]。

通过ITS 1高通量测序分析表明，金钗石斛种子内生真菌包括子囊菌门(97.04%)、担子菌门(2.84%)和接合菌门(0.12%)，其多样性比人参种子内生真菌相比低[30]。金钗石斛内生真菌中，已鉴定属包括德巴利酵母属、链格孢属、蜡盘菌属、粉褶菌属和小脆柄菇属等5个属，未被鉴定的真菌占内生真菌的8.41%。由于目前对内生真菌的研究较少，在属水平上，金钗石斛种子中还有许多内生真菌未被挖掘，有待进一步的研究。

目前，植物种子内生菌的作用尚未阐明，但已有研究表明，种子内生菌对宿主植物及种子具有调控作用。种子内生菌通常具有淀粉酶活性，以便在种子长期存活后利用淀粉并恢复生长[31]。黑麦草内生菌可产生细胞分裂素，并与植物产生的植物激素相互作用，从而调控种子的休眠[32]。种子通常在发芽后的12～24 h易受病原体入侵[33]，而一些早期在种子内定居的内生菌具有潜在的促生作用，从而促进幼苗生长和发育，并对植物病原菌具有抑制作用[34,35]。内生菌可产生如表面活性肽、伊枯草素(iturin)和分枝杆菌素等脂肽，具抗真菌活性[36]。Ruiz等报道了从水稻种子中分离的泛菌属、假单胞菌属、不动杆菌属等对弯孢霉属(Curvulariasp.)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和Phytiumultimum等病原菌具有拮抗作用[9]。另外，种子内生菌还能通过产生植物激素或促进植物营养，特别是氮、磷等的获得，促进植物生长[6,36,37]。从小麦种子中分离到的一株泛菌属细菌具有产植物生长激素吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)、铁载体、固氮和溶磷等能力，并对小麦赤霉菌(Fusariumgraminearum)具有很好的生物防治作用[23]。

由于金钗石斛种子存在后熟现象，且缺乏胚乳组织，使其种子萌发困难，需与真菌共生才能萌发[12]。金钗石斛种子内生菌群落结构和组成的初步阐明，为进一步明晰种子内生菌在金钗石斛种子萌发和幼苗生长发育中的作用奠定了基础，也对金钗石斛等兰科植物栽培提供指导。