杨 澜，彭 强，彭 婷，杜致辉，许红娟，陈之林

(1.贵州省农科院山茂园艺工程技术有限公司，贵阳 550006；2.贵州省农业科学院园艺研究所，贵阳 550006； 3.贵州大学农学院，贵阳 550025)

多肉植物(Succulents)是指根、茎、叶 3 种器官中任意1种具有发达的薄壁组织，用于储存植物生长所需的水分和养分，外观呈现出肥厚多浆的一类植物[1]。具有品种繁多、观赏性佳、经济价值高等特点。全世界约有10 000多种多肉植物，常见的多肉植物主要是景天科(Crassulaceae)、百合科(Liliaceae)、仙人掌科(Cactaceae)和番杏科(Aizoaceae)。传统的杂交育种是创制多肉植物新品种的主要手段。花粉是进行杂交育种的主要载体，其活力受自身遗传特性以及外界诸多因素的影响[2]。花粉萌发存在集体效应，一定区域内的花粉数量越多萌发情况越好，当花粉数量达不到一定程度时便不能满足正常萌发的要求，影响授粉受精过程的完成，挑选花粉数量多的品种进行授粉是顺利完成授粉受精过程的首要条件[3]。自然条件下绝大多数多肉植物品种自花授粉不结实或结实率低，杂交后也会出现杂种胚败育现象，杂交授粉工作在实际应用中存在一定的盲目性。因此对不同品种花粉活力高低的检测和选择合适的育种时期是杂交成功与否的关键，也是选择父本材料的重要依据。本试验拟通过对10种花粉量较大的景天科拟石莲属多肉植物进行花粉活力的检测及花粉萌发率的研究，摸索不同散粉时期的花粉活力差异、花粉离体培养的最适宜温度及适宜的观察时间，以期对提高多肉植物育种效率提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

以种植于贵州省农业科学院园艺研究所多肉种质保育棚5年生的拟石莲属多肉植物品种花月夜(EcheveriapulidonisWalther)、灵隐 (拟石莲属杂交种)、乌木(EcheveriaagavoidesEbony Red)、罗密欧(EcheveriaagavoidesRomeo)、布兰迪(Echeveriacoloratavar. Brandtii)、下弦月 (拟石莲属杂交种)、露娜莲(Echeverialola)、蓝丝绒(Echeveriasimulans)、黑爪(Echeveriamexensiszaragosa)、莎维娜(Echeveriashaviana)等10个品种为研究对象。

1.2 方 法

1.2.1不同散粉阶段的花粉活力测定方法

通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法染色快速测定不同散粉时期的花粉活力。TTC是一种氧化还原染料，能在呼吸酶的作用下着色，因此可根据着色情况来判断花粉生活力。2019年3月，在晴天09：00—10：00时之间，采集4个散粉阶段(第1阶段：未散粉；第2阶段：已散粉且柱头无粘液；第3阶段：已散粉且柱头有粘液；第4阶段：散粉后期柱头粘液消失)的花粉或花药，将采集的花粉挑入光片载玻片上，滴上现配制的TTC染液1～3滴，TTC染液的终浓度为0.5%，反复吸打混匀后放置于35 ℃的恒温培养箱暗光培养1 h。每个阶段的材料均制作3个玻片，即3个重复。每个载玻片下选择5个视野进行观察，花粉总数大于100粒即可，计算每个视野有活力的花粉粒数占总花粉粒数的百分率，结果取平均值。

花粉活力(%)=(染色的花粉数/花粉粒总数)×100%[4]。

1.2.2花粉的最佳培养条件和观察时间的确定方法

在晴天09：00—10：00时之间，采集供试材料第3阶段的花粉，用消过毒的镊子将花粉轻轻剥落在滴有培养液的载玻片上，小枪头反复吸打将花粉粒均匀散开，然后盖上盖玻片。将制好的玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中，分别放置于6个温度梯度下(10、15、20、25、30、35 ℃)的恒温培养箱中进行暗光培养9 h，每隔3 h用LEICA DM 2500显微镜观察花粉萌发情况。每个处理均制作3个玻片，即3个重复。每个载玻片随机选取3个视野(每个视野花粉不少于30粒)，统计每个视野花粉粒总数和萌发的花粉数，花粉萌发以花粉管长度大于花粉直径为标准[5]。计算离体花粉萌发率，结果取平均值。

离体花粉萌发率(%)=(萌发的花粉数/花粉粒总数)×100%。

试验溶液均用蒸馏水配制，液体培养液为10%蔗糖+0.5%琼脂[4]。

1.2.3数据统计与处理

用Excel软件进行数据整理及绘图，SAS 9.0软件对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同散粉时期的花粉活力检测

采用TTC染色法，以10个供试品种的多肉植物为材料，比较不同散粉阶段的花粉活力。染色结果表明：TTC染色法可以将10个供试品种的花粉染上色；不同散粉阶段的花粉活力存在显著性差异(p<0.05)；在花药未散粉的第1阶段花粉活力平均值为12.49%，刚散粉且柱头无粘液的第2阶段花粉活力平均值为15.07%，到散粉的第3阶段，柱头出现粘液时花粉活力平均值达到30.82%，花粉活力最强；随着花序的开放和散粉阶段的延续，散粉第4阶段柱头粘液消失后花粉活力平均值仅为15.05%。由图1可知，花月夜花粉呈现球形，且大部分花粉粒均被染成红色，表示这个阶段的花粉活力强。

注：A为20倍物镜下拍摄的图片，B为10倍物镜下拍摄的图片。图1 花月夜花粉散粉第3阶段的活力检测

表2 不同培养温度下多肉植物的离体花粉萌发率

表1 TTC染色法检测10个品种多肉植物不同散粉时期的花粉活力平均值

2.2 培养温度对不同多肉植物品种离体花粉萌发率的影响

在不同温度条件下离体培养一定时间后10个多肉品种离体花粉萌发率见表 2。离体培养结果显示: 蓝丝绒仅在20 ℃花粉萌发，其他温度下萌发率极低；莎维娜在10 ℃低温条件下无萌发；乌木在35 ℃高温条件下无萌发；其它品种在6个培养温度下花粉均有萌发；多数品种花粉离体培养最佳温度为20 ℃，萌发率达到最大值，布兰迪(25.14%)、黑爪(25.385%)、灵隐(20.74%)、露娜莲(20.72%)、蓝丝绒(21.7%)、罗密欧(28.743%)、乌木(17.86%)、下弦月(29.877%)；花月夜的试验数据显示花粉具有耐低温的能力，在15 ℃低温培养温度下萌发率最高，为44.44%；而莎维娜的花粉具有耐高温的能力，在30 ℃高温培养下花粉萌发率最高，为22.653%。数据还显示：4个多肉植物品种的花粉萌发率出现了2次峰值，呈现出先升高后降低再升高后降低的趋势；其中布兰迪(25.14%A、17.54%B)和罗密欧(28.743%A、18.517%B)的2次峰值分别出现在20 ℃和35 ℃，且2个峰值差异显著；莎维娜(12.95%B、22.653%A)和下弦月(29.877%A、25.13%AB)在20 ℃和30 ℃培养温度下出现峰值。

由表2还可见：培养温度对品种布兰迪、黑爪、罗密欧、莎维娜、乌木、下弦月离体花粉萌发率的影响差异极显著(p<0.01)；对花月夜和蓝丝绒的离体花粉萌发率影响表现为显著(p<0.05)；然而，灵隐和露娜莲在6个培养温度下的花粉萌发率差异不显著(p>0.05)。

注：A是在10倍物镜下拍摄的图片，B是在4倍物镜下拍摄的图片。图2 25 ℃培养3 h观察到布兰迪在培养基上离体萌发

2.3 不同品种花粉离体萌发的适宜观察时间

不同品种花粉萌发适宜的观察时间存在较大差异。供试品种布兰迪、花月夜、罗密欧、莎维娜、乌木、下弦月的花粉离体萌发适宜观察时间为3 h，萌发率分别为17.468%、22.222%、18.89%、12.007%、8.322%、24.870%，随着观察时间的延长各品种的花粉萌发率均不断下降。品种黑爪、灵隐、露娜莲、蓝丝绒的花粉离体萌发适宜的观察时间为9 h，离体花粉萌发率分别为28.02%、16.883%、8.462%、8.147%。

2.4 多肉植物花粉活力检测方法比较

双因素显著性分析(表3)发现：在离体培养法中，培养温度是影响10种多肉植物离体花粉萌发率的极显著因素(p<0.000 1)。如表4所示：花月夜的花粉在15 ℃低温下培养3 h离体花粉萌发率为66.67%；灵隐的花粉在15 ℃低温下培养9 h，萌发率达到29.51%；乌木、罗密欧、布兰迪在20 ℃温度下培养3 h的离体花粉萌发率分别为23.33%、35.56%、28.89%；下弦月、露娜莲花粉在20 ℃培养6 h，萌发率值为32.17%和34.12%；蓝丝绒和黑爪花粉在20 ℃下培养至9 h萌发率达到38.89%、48.91%。莎维娜的花粉在30 ℃高温条件下培养6 h后离体花粉萌发率为26.67%。

离体花粉培养法中以最适条件获得的不同品种离体花粉萌发率与TTC染色法检测10种多肉植物第3阶段的花粉活力值进行双因素显著性分析。表3数据显示：品种间离体花粉萌发率差异显著 (p=0.018 6)；而2种方法获得的花粉活力值差异不显著(p=0.219 2)。说明TTC染色法可作为快速检测多肉植花粉活力的方法，对指导多肉植物的杂交育种工作有重要的实际意义。图2中品种布兰迪在液体培养基上25 ℃培养3 h可见花粉离体萌发。

表3 不同变量因素的差异显著性分析

表4 离体花粉培养法和TTC染色法检测花粉活力

3 讨论与结论

3.1多肉植物的花粉活力是杂交育种的关键因素之一。品种、散粉时期、温度均是影响多肉植物花粉萌发的重要因素。本试验研究结果表明：多肉植物花粉活力在不同散粉阶段存在显著差异，这与在白玉兰[6]、非洲菊[7]上的研究结果相似。多肉植物散粉的第3阶段柱头出现粘液时花粉活力最强，平均值达到30.08%(表1)。显微镜下观察发现，此时的花粉呈现出圆球形，花粉粒被染成红色。推测多肉植物花粉活力与其成熟度有关，这与秦萌[8]在紫薇花中的研究结论相同，紫薇花盛花期的离体花粉萌发率>初开期>蕾期。

3.2差异显著性分析发现培养温度是影响多肉植物离体花粉萌发率的极显著因素(表3)。大多数品种虽然在10 ℃的低温下也能萌发，但萌发率很低，极大的影响多肉植物的授粉结实率。因此，适宜的培养温度是提高花粉萌发率的重要因素。不同物种花粉最佳离体萌发温度差异很大。花魔芋花粉离体培养的最适培养温度为28 ℃[9]；黄刺玫[10]、望春玉兰、 长花玉兰、丹馨玉兰、黄山木兰花粉萌发最佳培养温度均为25 ℃，温度过高会抑制花粉萌发[11]。本试验中，20 ℃是大多数供试品种花粉萌发的最适宜温度，离体花粉萌发率达到最大峰值。布兰迪28.89%、黑爪48.91%、露娜莲34.12%、蓝丝绒38.89%、罗密欧35.56%、乌木23.33%、下弦月32.17%。花月夜、灵隐的花粉在较低的温度下活力高，本试验中的最适萌发温度为15 ℃，萌发率分别达到66.67%、29.51%。而莎维娜的花粉具有耐高温的能力，在30 ℃高温培养下花粉萌发率最高，为26.67%(表4)。4个多肉植物品种(布兰迪、罗密欧、莎维娜、下弦月)的花粉萌发率在6个温度梯度下呈现出先升高后降低再升高后降低的趋势，先后出2次峰值。其中品种布兰迪(20 ℃/25.14%A、35 ℃/17.54%B)、罗密欧(20 ℃/28.743%A、35 ℃/18.517%B)、莎维娜(20 ℃/12.95%B、30 ℃/22.653%A)的2个峰值差异显著(表2)，这可能与品种特性有关，需要进一步深入研究。

3.3花粉完成其生理生化过程需在一定的培养时间范围内，不同种类的植物花粉萌发所需的时间差异较大。花魔芋花粉离体培养最适观察时间仅为4 h[9]，楸树花粉萌发的适宜培养时间则为6 h[12]，杜仲花粉的培养时间应达到18 h[13]，果梅花粉的最佳培养时间为24 h[14]。香椿花粉生活力的最佳离体培养时间为30 h[15]。本试验中，不同品种的花粉离体萌发的适宜观察时间存在较大差异。由表4可知：花月夜、乌木、罗密欧、布兰迪的花粉萌发观察时间以3 h较好；下弦月、露娜莲、莎维娜花粉萌发的适宜观察时间为6 h；灵隐、蓝丝绒、黑爪则需要培养至9 h进行观察。与离体萌发法不同的是TTC染色法具有操作简单，需时短的优点，在实际育种过程中TTC染色法常被用于玉米[16]、大豆[17]、萱草[18]等植物的花粉活力快速检测。本试验2种方法分别在最佳条件下测得的花粉活力差异不显著(p=0.219 2)，这与林开勤等[19]在茶树花粉活力测定方法研究上的结果一致。TTC染色法更有利于快速检测多肉植物的花粉活力。