郭靖宜 许 刚

（辽宁省地质矿产研究院有限责任公司 辽宁 沈阳 110032）

前 言

在很久之前我们的祖先就发现了砷的化合物，但是一直到上个世纪人类才开始研究砷的化合物，人类通过饮食将食物与饮用水中的砷富集到体内，研究表明当人类长期饮用砷含量高的水，患皮肤癌与其他内脏癌的概率很高，低含量砷暴露能否致癌是科学家们争论的焦点[1]。尽管如此砷被各大研究机构定为致癌物[2]。

元素在不同形态时，其毒性大小也不相同，在砷的各化合物中，AsB以及AsC对人类没有危害，有机砷形态存在时毒性很小，而无机砷形态存在时毒性最大，因此在研究砷元素在动物体内的生理与毒理作用，需要分析砷元素各个形态[3～5]。单一的仪器或技术显然不能满足要求。

自20世纪80年代，仪器联用被Chesterfield提出，之后仪器联用技术发展进入快车道，许珺辉等采用高效液相色谱分离样品，使用氢化物发生原子荧光光谱法测定了尿液中砷元素的四种形态，Ma Ming-sheng等[6]用同样的方法分析了尿液中砷的四种形态，并取得了一定的效果，而国内外专家认为元素形态分离发展最完善的技术是HPLC-ICP-MS联用，因此本文采用HPLC与ICP-MS联用，对两种分析样品中砷元素的各形态进行定性与定量分析[7～8]。

1 实验部分

1.1 实验材料、试剂

砷标准物质：三价砷酸根（AsO33-）、五价砷酸根（AsO43-）、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱（AsB）、砷胆碱（AsC）；四丁基氢氧化氨（TBAH），丙二酸，甲醇（色谱纯）。

1.2 实验仪器

1.2.1H P L C仪器工作条件

Waters626型高效液相装置，以μm Kromasil硅胶为填料的反相C18色谱柱（150mm×4.6mm id）用于色谱的分离。

最佳流动相组成：18.8mM四丁基氢氧化氨，2mM丙二酸，4%甲醇（PH=5.95），流速：1ml.min-1进样量：25μL。

1.2.2I C P-MS操作条件

采用Thermo公司的Xseries2型ICP-MS系统，配有Scott玻璃同心雾化器，由于用ICP-MS作为检测器，砷的检测受到所用载气Ar与Cl原子的干扰，所以要用碰撞反应池技术来测定[9]，具体参数见表1。

表1 典型的ICP-MS条件Table 1 The typical conditions for ICP-MS

1.3 样品的采集及前处理

1.3.1 人体尿样

尿样是经过ICP-MS测定后重金属含量较高的样品（尤其是总砷的含量），因为采集后不能及时分析，因此加少量酸后于-30℃冷藏。分析前解冻，样品不用稀释直接用一次性注射器经PhenoIilenex 0.45μm孔径的有机滤膜过滤。

1.3.2 环境水样

水样采自沈阳浑河河水，样品采集时分六点采样，每处的样品首先经过滤膜过滤，然后集中装入经过二次水多次洗涤的PE瓶中。因为采回来的样品是直接进行分析的，因此不需冷藏，只需加少量酸酸化后用一次性注射器经PhenoIilenex 0.45μm孔径的有机滤膜过滤。

1.4 实验设计及具体操作

1.4.1 标准配制

用购买国家标准配制成1mg/ml的六种砷的储备液，于棕色容量瓶内冷藏。分析前用millpore系统净化的水（18.2MΩ）将贮备液配制成10ng/ml的混合标准和六种砷的单标，作为建立标准曲线的标准溶液。

1.4.2 砷形态分析方法

首先用ICP-MS对砷含量较高的人体尿液进行砷总量的测定。通过一根PEEK管将Waters626型高效液相色谱的出口端与ICP-MS的进样口相连，采用时间分辨模式（TRA）来监控被分析物信号[10～11]。

用混合标准和单标来确定六种砷的保留时间，然后用微量注射器将经过处理后的人体尿液与浑河河水注入25μl的进样环，每个样品平行3次，并做了两个不同浓度的加标回收实验，同样重复3次。最后根据峰面积积分来计算每种形态的含量和加标回收率，从而检验整个分析方法可行性。

2 结果和讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1T B A H浓度的影响

四丁基氢氧化氨（TBAH）在流动相作为离子对试剂。其浓度的大小决定砷各形态的分离程度，实验中逐步增加TBAH的浓度，当其浓度增加到18.8mM时，即可消除As（Ⅲ）和DMA的峰重叠，同样也可消除As（Ⅴ）与MMA的重叠[12]，因此最终流动相中TBAH的浓度18.8mM见图1。

图1 TBAH浓度对砷形态保留时间的影响Fig.1 The effect of TBAH concentration on the retention time of arsenic species

2.1.2 丙二酸浓度的优化

图2 丙二酸的浓度对砷形态保留时间的影响Fig.2 The effect of malonic acid concentration on the retention time of arsenic species

流动相中的缓冲溶液一般是用来分离酸性和碱性分析物的，不同的分析物缓冲液的种类和浓度也不同[13]。在砷形态研究中经常使用丙二酸作为缓冲液。丙二酸浓度不同，每种砷形态保留时间也不相同，在实验中不断增加丙二酸的浓度，随着丙二酸浓度的增加，As（V）的保留时间显著的缩短。当丙二酸的浓度为1mol/L时As（V）的保留时间的变化趋于平和，当丙二酸的浓度为2mmol/L可以使As（V）和砷的其他形态得到有效分离，最终确定丙二酸的浓度为2mmol/L见图2。

2.1.3 甲醇浓度的影响

在流动相中加入少量甲醇可以增强ICP-MS检测砷信号的灵敏度。在实验时分别在流动相中加入0%～4%（V/V）的甲醇，图3所示，加入不同量甲醇对砷各形态的保留时间并没有显著的影响。但是，考虑到甲醇浓度会影响砷各形态信号的强度，因此确定甲醇的最佳加入量为4%（V/V）。

图3 甲醇浓度对砷各形态保留时间的影响Fig.3 The effect of methanol concentration on the retention time of various arsenic species

2.2实际样品的分析

2.2.1混合标准中砷形态的确定

用优化好的色谱分离条件对10ng/mL的单标和混合标准进行分析，分别测定三次来确定每种砷形态的出峰时间，从而根据峰面积建立标准曲线，见图4。

图4 10ng/mL时六种砷形态混合标准的色谱峰（从左至右依次为：AsC,AsB,As（III）,DMA,MMA,As（V）Fig.4 The chromatographic peaks of the mixed standard of six arsenic species with a concentration of 10ng/mL（From left to right：AsC,AsB,As（III）,DMA,MMA and As（V）

2.2.2 尿液中砷形态的分析

采用优化的色谱分离条件对人体尿液中的砷形态进行分析，通过标准的出峰位置来确定尿液中所含砷的形态。首先测定了样品中所含砷的总量，而砷各形态含量的总和相对于总量的比值为97%；对样品平行测定三次，相对标准偏差小于3%，取其浓度平均值。测定出样品中含有三种形态的有机砷，其含量列于表2，同时设计了两个浓度的加标回收率的实验。图5是尿液中所含砷各种形态的色谱峰，图6则是加入10ng/ml的混合标准的色谱峰。

图5 尿液中的砷形态的色谱峰Fig.5 The chromatographic peaks of the arsenic species in urine

图6 加标为10ng/ml的尿液的色谱峰Fig.6 The chromatographic peaks of the urine with a standard concentration of 10ng/mL

2.2.3 浑河河水中砷形态的分析

浑河河水属于环境水样，通过三次平行测定，样品中没有检测出砷的任何形态。ICP-MS对浑河和水中砷的总量进行测定同样未检出。

2.3 加标回收率实验

由于没有标准物质，为了验证整个分析方法的可行性，设计了两个浓度梯度的加标回收实验，其回收率都在99.8%～110%之间，这说明该分析方法在一定程度上还是具有可信度的。人体尿样与浑河河水中各形态砷的含量以及加标回收率列于表2。

表2 尿液和浑河河水中各种砷形态的含量、总砷含量及加标回收率Table 2 The contents of various arsenic species,total arsenic content,and the standard recovery rate in urine and water from Hunhe River

3 结论

尝试采用反相离子对高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）联用测定砷元素的各种形态，并对色谱条件进行了一系列的优化，最终成功地分离了沈阳浑河河水样和尿样中As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA、DMA四种砷化合物，取得了理想的实验效果。