刘真阳 张碧霄 李非凡 梅晓宏

摘 要：目的：优化白果中植物甾醇的提取并考察其体外释放情况。方法：以白果为原料，以乙醇为提取溶剂，使用超声波辅助提取法，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化了白果中植物甾醇的提取工艺，进一步通过体外模拟消化试验，分析了添加油脂、热处理方式、物料粉碎程度对甾醇体外释放的影响。结果：超声时间、料液比、超声功率均影响甾醇的提取率。超声功率对提取率具有显著影响，最佳工艺为超声时间6 min、料液比1∶15 g/mL、超声功率350W，此时可得最大甾醇提取率为0.878 mg/（g·dw）。体外模拟消化试验证明，添加油脂、热处理方式、物料粉碎程度均对植物甾醇的体外释放具有显著影响，当使用微波加热处理时，甾醇的释放情况最佳。

关键词：白果;植物甾醇;模拟消化

银杏的种子——白果，其营养丰富，具有益肺气、治喘咳、止滞浊、扩张微血管、增加血流量等药用功效，食用价值很高[1 2]。植物甾醇是植物中的活性成分，其广泛存在于各种植物油、坚果和植物种子中，在结构上与胆甾醇相似[3]。作为一类独特的多功能活性因子，植物甾醇具有许多重要的生理功能，在心血管疾病的预防与缓解、抗肿瘤以及消炎退热等方面应用前景广阔[4 6]。基于植物甾醇对人体的诸多功能及其特有的性质，植物甾醇已在医药、食品、化妆品等行业中得到了广泛应用[7 8]。然而，人体不能合成植物甾醇，只能从食物中摄取。且膳食中植物甾醇的吸收率较低，约为0.02%～3.5%[9]，这与植物甾醇的水溶性差有关，已有研究证明，烹调过程中添加适量油脂有利于提高脂溶性成分的生物利用率[10]。不仅如此，烹调方式与物料性质对营养成分的释放具有较大影响[11 12]。目前，对于白果中植物甾醇的研究较少。本研究对白果中的植物甾醇进行提取工艺优化、含量测定，并分析体外释放情况，模拟蒸、煮、微波3种烹饪方式对甾醇释放的影响，以期提高白果的利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白果、大豆油，购于当地超市;β 谷甾醇标准品、胃蛋白酶、猪胆盐、脂肪酶，美国Sigma公司;无水乙醇、六水合三氯化铁、无水氯化钙、磷酸氢二钾、氯化钠、氢氧化钾、磷酸，分析纯，购自西亚试剂。

1.2 仪器与设备

FW100型高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司;Varioskan Flash全波长酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司;JY98 IIIN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;101 0ES型电热鼓风干燥箱，上海科恒实业发展有限公司;TGL 16M台式高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司;LGJ 25C型冷凍干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验 预先将白果去壳、冷冻干燥并粉碎处理，记录冻干前、后白果的重量，分别记为Wf、Wd，并计算白果的含水率[13]，公式为式（1）：

含水率（%）=Wf-WdWf×100（1）

以冻干后的白果粉为原料，选择无水乙醇为提取溶剂，使用超声波细胞破碎仪进行白果中植物甾醇的提取。准确称取2.0 g白果粉，加入一定量的无水乙醇，使用超声波细胞破碎仪破壁处理，将提取液置于70℃烘箱中，彻底烘干，之后重新加入20 mL无水乙醇，混合均匀后，取溶有植物甾醇的乙醇溶液用于后续植物甾醇的定量分析，计算干物质（白果粉）中植物甾醇的含量[mg/（g·dw）]，下同。固定料液比1∶10 mL/g、超声时间6 min，选取超声功率分别为200、250、300、350、400W进行试验，考察超声功率对植物甾醇提取率的影响。在料液比为1∶10 mL/g、超声功率为350 W的条件下，选取超声时间分别为2、4、6、8、10 min进行试验，考察超声时间对植物甾醇提取率的影响。在超声功率为350 W、超声时间为6 min的条件下，选取料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 mL/g进行试验，考察料液比对植物甾醇提取率的影响。

1.3.2 植物甾醇提取的正交试验 单因素试验结果表明，超声时间（A）、料液比（B）、超声功率（C）均可影响白果中植物甾醇的提取。为获得最佳甾醇提取率，采用正交试验L9（34）对上述因素进行优化（表1）。

1.3.3 植物甾醇含量的测定 采取硫磷铁法测定样品中植物甾醇的含量[14]。精确称取1.25 g六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O），使用85%的磷酸定容至50 mL，制得铁贮存液，室温下可长期贮存于棕色瓶中。量取8 mL铁贮存液，使用浓硫酸定容至100 mL，制得硫磷铁显色剂。标准曲线的绘制方法为：使用少量无水乙醇将10 mg β 谷甾醇标准品溶解，并转入100 mL容量瓶中定容。使用前稀释10倍，即母液质量浓度为0.01 mg/mL。分别取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL的0.1 mg/mL β 谷甾醇溶液于试管中，继续添加无水乙醇至4.0 mL，加入2.0 mL硫磷铁显色剂，振荡摇匀，15 min后在波长750～450 nm内扫描，确定最大吸收波长。并以β 谷甾醇溶液质量浓度（单位为mg/mL）为横坐标、以吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线。根据样品在最大吸收波长处的吸光值以及拟合线性良好的标准曲线计算样品中植物甾醇的含量。

1.3.4 体外模拟胃肠道消化试验 参考Huang等[15]的方法并稍作修改。将新鲜白果去壳，称取5 g去壳白果，并对其进行3种烹调处理，分别为：（1）煮：沸水中煮约15 min;（2）蒸：隔水加热约30 min;（3）微波：微波加热约5 min。之后，将熟白果分别进行粉碎与切块（0.3 cm3左右）处理，模拟消化前加入不同质量的大豆油（不添加、0.5 g、1.0 g、1.5 g）。在此基础上，研究烹调方式、粉碎程度、油的添加量对熟白果中植物甾醇释放率的影响。模拟消化过程为：按照1∶10（w/v）的比例将白果与50 mL模拟胃液[0.32%胃蛋白酶（3 000 U/mL），0.2%NaCl，w/v]混合，使用1 mol/L HCl调节pH至2.0，在37℃、120 r/min的恒温摇床中模拟胃消化1 h。之后，按照1∶10（w/v）的比例向胃消化 1 h后的样品中加入50 mL模拟肠液（0.68%K2HPO4、5 mmol/L CaCl2、10 mg/mL猪胆盐、0.4 mg/mL脂肪酶，w/v），使用1mmol/L NaOH调节pH至8.0，在37℃、60 r/min的恒温摇床中继续模拟肠消化2 h。

消化结束后，将消化液在8 000 r/min下离心10 min，离心后，上层为含有甾醇的油相，中层为水相，下层为消化后的固体残渣。取上层油相进行皂化处理，具体方法为：称取50 mg油脂样品，加入2 mL皂化液（2 mol/L氢氧化钾 乙醇溶液），加盖密封，混匀，涡旋振荡 1 min;置于70℃恒温水浴锅中振摇皂化45 min。室温冷却后加入二氯甲烷5 mL、超纯水3 mL，混合均匀， 6 000 r/min离心5 min，使用分液漏斗收集下层有机相，使用5 mL超纯水清洗3次，弃上清，烘干有机相。使用无水乙醇重新定容至10 mL，用于后续植物甾醇的定量分析。以加入等量大豆油为对照组，计算模拟消化后植物甾醇的释放量，公式为式（2）：

释放量[mg/（g·dw）]=处理组甾醇含量-对照组甾醇含量1-含水量（2）

1.4 数据处理与分析

每个试验均重复3次，使用SPSS 17.0软件进行方差试验设计与单因素方差分析，P<0.05表示差异显著;使用Origin 8.0软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

β 谷甾醇溶液质量浓度（mg/mL）与吸光度值（A）的线性关系如图1所示，标曲方程为Y（A）=5.007X-0.012，决定系数R2=0.987 7，说明拟合情况良好，可用于后续试验中植物甾醇的定量分析。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声时间对植物甾醇提取率的影响 由图2可知，当超声时间为2～10 min时，植物甾醇提取率呈现出先增大再减小的变化趋势，在8 min时达最大值，且显著高于其他组（P<0.05），因此选择6、8、10 min三个水平用于后续优化试验。

2.2.2 料液比对植物甾醇提取率的影响 由图3可知，当料液比为1∶15 mL/g时提取率最大，显著高于其他组（P<0.05），因此选择1∶10、1∶15、1∶20 g/mL三个水平用于后续优化试验。

2.2.3 超声功率对植物甾醇提取率的影响 由图4可知，当超声功率为200～400 W时，植物甾醇提取率呈现出先增大再减小的变化趋势，当超声功率为350W时达最大值，且显著高于其他组（P<0.05），因此选择300、350、400 W三个水平用于后续优化试验。

2.3 正交试验及方差分析

按照正交试验表进行提取优化，如表2所示，根据正交试验的直观分析法可得到因素的主次顺序依次为超声功率（因素C）、料液比（因素B）、超声时间（因素A）。主要因素（超声功率）取最佳水平，次要因素（超声时间、料液比）根据成本等取适当水平，由此得到各因素的最佳搭配为A1B2C2，即最佳工艺为超声时间6 min、料液比1∶15 g/mL、超声功率350W，此时可得最大甾醇提取率为0.878 mg/（g·dw）。如表3所示，只有超声功率（因素C）的P值=0.014<0.05，即超声功率对试验结果影响显著，而超声时间（因素A）与料液比（因素C）的P值均大于0.05，说明二者对甾醇提取率具一定影响，但并不显著。即超声功率为主要因素，超声时间与料液比为次要因素，这一结果与直观分析法的结论相符。

2.4 体外模拟消化处理中植物甾醇的释放情况

如表4所示，其中未加入大豆油时，离心后仅有水层与下层残渣，无明显上层油相，因此无法检测到甾醇的释放情况，这是因为白果的脂肪含量较少，仅占鲜重的2%左右，这也说明，仅有加热处理与消化液不足以促进甾醇的释放。样品粉碎后，使用微波处理时，随着油的增多，甾醇释放率呈现出显著上升后趋于平稳的趋势（P<0.05）;使用蒸、煮处理时，加入1.5 g大豆油时甾醇的释放率显著升高（P<0.05），这说明添加油脂可以有效改善甾醇的释放情况，这是因为植物甾醇是一种极性较弱且微量的物质，同样弱极性的油脂可以较好地溶解植物甾醇，这与已有研究结果相似[16]。当添加等量大豆油时，微波处理后甾醇的释放率均显著高于蒸、煮处理（P<0.05），这说明，与蒸、煮相比，微波处理可以更有效地促进白果中植物甾醇的释放，这可能是由于微波处理能够有效地破壁，使细胞内容物释放到油脂中[17]。对于块状样品，不同处理方式下其甾醇释放率均较低，且处理方式对其甾醇释放率无显著影响（P<0.05），这说明物料的粉碎程度对甾醇的释放影響较大，这可能是因为粉碎处理增大了物料与消化液的接触面积。樊金岭等[18]研究表明，不同机械加工方式对胡萝卜中β 胡萝卜素生物接近度的影响较大，打浆处理可有效提高β 胡萝卜素的释放率与胶束化率。上述结果说明，添加油脂更有利于甾醇的释放，而微波处理可代替传统蒸、煮，进一步促进白果中甾醇的释放。

3 结论

本研究使用超声波辅助提取法进行白果中植物甾醇的提取，通过单因素试验，验证了超声时间、料液比、超声功率均会影响甾醇的提取率。在此基础上，通过正交试验发现，超声功率对甾醇提取率具有显著影响（P<0.05），因素的主次顺序依次为超声功率、料液比、超声时间，最佳工艺为超声时间6 min、料液比1∶15 g/mL、超声功率350W，此时可得最大甾醇提取率为0.878 mg/（g·dw）。通过体外模拟消化试验分析白果中植物甾醇的体外释放情况，发现粉碎样品与添加油脂均有利于甾醇的释放，与传统蒸、煮相比，微波处理可进一步促进甾醇的释放。◇

参考文献

[1]阎小红，赵洁.银杏的营养价值及其加工利用[J].农产品加工，2013（12）：44 45.

[2]梁子红，谢鹏，朱润秀，等.银杏叶提取物对神经系统疾病作用的研究进展[J].中国实用神经疾病杂志，2018，21（5）：570 575.

[3]Moreau R A，Whitaker B D，Hicks K B.Phytosterols，phytostanols，and their conjugates in foods：structural diversity，quantitative analysis，and health promoting uses[J].Progress in Lipid Research，2002，41（6）：457 500.

[4]Simin Feng，Zhuqing Dai，Anna B，et al.Intake of stigmasterol and β sitosterol alters lipid metabolism and alleviates NAFLD in mice fed a high fat western style diet[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA） Molecular & Cell Biology of Lipid，2018，1863（10）：1274 1284.

[5]Shin E J，Choi H K，Sung M J，et al.Anti tumour effects of beta sitosterol are mediated by AMPK/PTEN/HSP90 axis in AGS human gastric adenocarcinoma cells and xenograft mouse models[J].Biochemical Pharmacology，2018，152：60 70.

[6]Robert A Moreau，Laura Nystrim，Bruce D Whitaker，et al. Phytosterols and their derivatives：structural diversity，distribution，metabolism，analysis，and health promoting uses[J].Progress in Lipid Research，2018，70：35 61.

[7]Plumb J A，Mjc R，Lampi A M，et al.Phytosterols in plant foods：exploring contents，data distribution and aggregated values using an online bioactives database[J].Journal of Food Composition & Analysis，2011，24（7）：1024 1031.

[8]Simin Feng，Zhuqing Dai，Anna B，et al.Intake of stigmasterol and β sitosterol alters lipid metabolism and alleviates NAFLD in mice fed a high fat western ;style diet[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA） Molecular & Cell Biology of Lipid，2018，1863（10）：1274 1284.

[9]韩军花，杨月欣，冯妹元，等.中国常见植物食物中植物甾醇的含量和居民摄入量初估[J].卫生研究，2007，36（3）：301 305.

[10]代蕾，孙翠霞，刘夫国，等.油脂添加及加工模式对果蔬中类胡萝卜素生物接近度影响[J].中国食品添加剂，2016，143（1）：27 32.

[11]常丽新，韩近，王换霞.不同烹调方法对野生蔬菜营养成分的影响[J].食品工业科技，2005，26（4）：163 168.

[12]Cilla A，Bosch L，Barberá，Reyes，et al.Effect of processing on the bioaccessibility of bioactive compounds A review focusing on carotenoids，minerals，ascorbic acid，tocopherols and polyphenols[J].Journal of Food Composition and Analysis，2017，68：3 15.

[13]馮景，沈永宝，史锋厚.银杏种子脱水敏感性的研究[J].南京林业大学学报（自然科学版），2019，43（6）：193 200.

[14]刘蕾，陈星，李晓丽，等.分光光度法测定大豆总甾醇含量的研究[J].中国油脂，2005（4）：45 47.

[15]Huang Haizhi，Sun Yujing，Lou Shuting，et al.In vitro digestion combined with cellular assay to determine the antioxidant activity in Chinese bayberry（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）fruits：a comparison with traditional methods[J].Food Chemistry，2013，146：363 370.

[16]白喜婷，樊金玲，朱文学，等.机械加工及油脂对南瓜类胡萝卜素生物接近度的影响[J].食品与机械，2014，30（5）：3 9.

[17]Colle I J P，Lemmens L，Van Buggenhout S，et al. Processing tomato pulp in the presence of lipids：The impact on lycopene bioaccessibility[J].Food Research International，2013，51（1）：32 38.

[18]樊金玲，宋會娟，孙玉宇，等.机械加工方式及油脂对胡萝卜中β 胡萝卜素生物接近度的影响[J].食品科学，2014，35（15）：25 29.

Extraction Optimization and in Vitro Release of Phytosterol from Ginkgo

LIU Zhen yang，ZHANG Bi xiao，LI Fei fan，MEI Xiao hong

（College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Abstract： Objective To optimize the extraction of phytosterol from ginkgo and further evaluate in vitro release of phytosterol. Method Ultrasonic assisted extraction was used and orthogonal test was applied for optimization.Simulated digestion experiment was carried out to analyze the effect of additional oil，heat treatment and grinding on in vitro release of phytosterol. Result Based on the single factor experiment，extraction time，solid liquid ratio，and ultrasonic power could affect extraction efficiency，while only ultrasonic power showed significant influence according to orthogonal test.Besides，the optimization was extraction time 6 min，the ratio of material to solvent 1∶15 g/mL，and ultrasonic power 350 W.Under these conditions，the theoretic yield was 0.878 mg/（g·dw）.Simulated digestion experiment evidenced that additional oil，heat treatment and thorough grinding facilitated phytosterol release，and microwave heat treatment showed the best release ratio.

Keywords：ginkgo;phytosterol;simulated digestion