严礼 肖稳 郭焜鹏 何娟 刘卓灵 余正

摘 要：目的：研制一种对沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志贺氏菌（Shigella）和单增李斯特菌（Listeria monocytogens）的选择性共增菌培养基（SSSL培养基）。方法：挑选添加成分进行单因素试验，确定SSSL培养基的成分及配比，采用平板计数法验证SSSL培养基的增菌效果。结果：确立了SSSL培养基配方，目标菌在SSSL增菌培养基中培养8 h后，菌体浓度都达到了105～10 6CFU/mL，而且抑制非目标菌的生长。结论：SSSL培养基能用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单增李斯特菌选择性共增菌，可望与多种检测方法联用，以提高检测率和准确性。

关键词：沙门氏菌;金黄色葡萄球菌;志贺氏菌;单增李斯特菌;共增菌;选择性培养基

食源性致病菌的污染是导致食品安全问题的重要因素[1]，食源性致病菌的快速检出是有效预防和控制食源性疾病的关键点。沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志贺氏菌（Shigella）和单增李斯特菌（Listeria monocytogens）是常見的污染肉类、果蔬、海产品而引发致病的菌种，所以这4种常见食源性致病菌的快速检出尤为重要和迫切[2]。这几种食源性致病菌的检测方法已经得到确定，其中沙门氏菌的国家标准方法[3]检出时间一般是6～7 d;金黄色葡萄球菌的国家标准方法[4]检出时间一般是4～5 d;单增李斯特菌的国家标准方法[5]检出时间一般是5～7 d;志贺氏菌的国家标准方法[6]检出时间一般是4～6 d。多重PCR[7]、多重荧光PCR[8]、DNA微阵列杂交技术[9]、免疫微阵列技术[10]和生物传感器[11]等一系列新技术新方法也逐步应用于微生物检验领域中，传统的微生物培养检测法和现代检测技术都需要增菌过程，微生物培养基是富集多种目标菌而达到检测限、缩短增菌时间和降低检测背景复杂性的有效手段，更是实现各种检测方法简化，实现快检和共检的重要基础。本研究旨在提供能够培养沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单增李斯特菌的选择性共增菌培养基（SSSL培养基），这将能优化4种食源性常见致病菌的传统微生物检测方法，也能更好地体现现代快速检测方法的效率。

1 材料与方法

1.1 菌种

肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis，CMCC 47731）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC 41002）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri，CMCC 51571）、单增李斯特菌（Listeria monocytogens，CMCC 34761）、大肠杆菌（Escherichia coli，CMCC 44102）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，CMCC 20015）均为本实验室保藏菌株;枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，CMCC 63501）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus，CMCC63301）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa，CMCC 10211），青岛海博生物技术公司;小肠耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica，CMCC 52225），中国医学细菌保藏管理中心。

1.2 主要试剂与仪器

胰酪胨大豆肉汤（TSB），美国BD公司;麦芽提取物、蛋白胨，英国OXOID公司;谷氨酰胺，美国Thermo Fisher公司;牛肉浸膏、氯化钠、丙酮酸钠、葡萄糖、磷酸吡哆醛、维生素B 12，国药集团化学试剂有限公司;氯化锂、亚碲酸钾、萘啶酮酸、去氧胆酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸铁铵，上海君川科技有限公司。

THZ 103B恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司;SPX 100B Z生化培养箱，上海博讯医疗生物仪器股份公司;UV 2550 紫外分光光度计，日本岛津公司;FE28 pH计，瑞士梅特勒 托利多公司;TE124S 电子天平，德国赛多利斯公司。

1.3 SSSL培养基研制

1.3.1 共增菌基础培养基配制 分别称取胰酪蛋白胨肉汤30.0 g、麦芽提取物5.0 g、葡萄糖2.5 g、氯化钠 10 g加入到1 000 mL蒸馏水中，混匀，调节pH值至7.3，灭菌后4℃保藏备用。

1.3.2 共增菌培养基添加成分及配比筛选 以共增菌基础培养基为出发培养基，选取可能的抑制剂和促进剂：萘啶酮酸、氯化锂、亚碲酸钾、去氧胆酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸铁铵、谷氨酰胺、磷酸吡哆醛、维生素B 12作为添加剂成分。将4种目标菌分别接种营养琼脂斜面，转接2次后用无菌生理盐水梯度稀释，按照102 CFU/mL起始量逐一接种于分别添加了上述10种添加剂各3个水平的基础培养基中，作为添加剂筛选组，以不含添加剂的共增菌基础培养基为空白对照组，37℃培养24 h，测定A  600nm值，计算抑制率。

1.4 营养肉汤培养基（NB培养基）配制

分别称取牛肉浸膏 3.0 g、蛋白胨 10.0 g、氯化钠5.0 g加入到1 000 mL蒸馏水中，混匀，调节pH值至7.4，灭菌后4℃保藏备用。

1.5 4种目标菌在SSSL培养基中生长效果验证

按照102CFU/mL起始量，将4种目标菌分别接种到100 mL SSSL培养基及NB培养基中，37℃、180r/min振荡培养24 h。分别取4、8、12、16、20、24 h的培养物以平板计数琼脂进行计数，平行试验10次，NB培养基为对照组，对不同时间的菌体浓度进行对比。

1.6 SSSL培养基的选择性验证

按照102CFU/mL起始量，将4种目标菌和6种非目标菌接种于SSSL培养基及NB培养基中，分别在37℃、180 r/min振荡培养6、12 h，测定培养物的A  600nm值，平行试验10次，NB培养基为对照组，观察目标菌与非目标菌的生长情况。

1.7 统计学分析

利用SPSS 22.0软件对4种目标菌在SSSL培养基中及在NB培养基中的生长情况进行配对t检验，进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 共增菌培养基添加成分及配比确定

表1结果显示，氯化锂随着浓度的增加对福氏志贺氏菌和单增李斯特菌的抑制作用均加强，而肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生长稳定，故取氯化锂的浓度为0.5 g/L。当亚碲酸钾浓度为0.3 mg/mL时，肠炎沙门

氏菌、福氏志贺氏菌和单增李斯特菌的抑制率超过了50%，当亚碲酸钾浓度为0.1 mg/mL和0.2 mg/mL时，对4种目标菌抑制作用都不明显，且两种浓度抑制率无明显差异，考虑到亚碲酸钾可抑制除凝固酶阳性葡萄球菌外多数细菌，故确定亚碲酸鉀浓度为0.2 mg/L。萘啶酮酸对肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌抑制作用非常强烈，而柠檬酸钠对金黄色葡萄球菌抑制作用非常强烈，故不考虑添加。当去氧胆酸钠浓度为0.3 g/L时，对单增李斯特菌的抑制率超过了50%，当浓度为0.5 g/L时对黄金色葡萄球菌的抑制率超过了50%，当浓度为0.1 g/L时对4种目标菌都较为温和。当柠檬酸铁铵浓度为 1.0 g/L时，对志贺氏菌的抑制率超过了50%，当浓度为2.0 g/L时对金黄色葡萄球菌的抑制率超过了50%，故确定柠檬酸铁铵添加浓度为0.5 g/L。丙酮酸钠、谷氨酰胺、磷酸吡哆醛和维生素B 12对目标菌增菌都有促进作用。丙酮酸钠的促进作用随着浓度的提高而提高;当谷氨酰胺浓度为1.0 g/L时，有一定的抑制作用，可能与谷氨酰胺降解产生过多的游离氨抑制微生物生长有关;磷酸吡哆醛随着浓度的增加，促进作用无明显增加;维生素B 12随着浓度增加，促进作用变小，故确定丙酮酸钠浓度为4.0 g/L、谷氨酰胺浓度为0.5 g/L、磷酸吡哆醛浓度为1.0 mg/L、维生素B 12浓度为1.0 mg/L。SSSL培养基配方确定为胰酪胨大豆肉汤30.0 g、麦芽提取物5.0 g、葡萄糖2.5 g、谷氨酰胺0.5 g、丙酮酸钠4.0 g、磷酸吡哆醛1.0 mg、维生素B 121.0 mg、氯化钠10 g、氯化锂0.5 g、亚碲酸钾0.2 mg、去氧胆酸钠0.1 g、柠檬酸铁铵0.5 g、蒸馏水1 000mL。

2.2 4种目标菌在SSSL培养基中生长效果的验证

肠炎沙门氏菌在SSSL培养基培养不同时间点的增菌速度优于NB培养基对照组，相比对照组增菌效果明显，组间差异有统计学意义（P<0.05），且在20 h两种培养基中的菌液浓度都达到了最高值（表2）。

福氏志贺氏菌相比NB培养基对照组有一定滞后性，整体落后于NB培养基对照组，组间差异有统计学意义（P<0.05），但当增菌时间达到24 h时福氏志贺氏菌在两种培养基中菌液浓度都达到了10 8CFU/mL，组间差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。

金黄色葡萄球菌在两种培养基培养4 h以后，每4 h增菌速度明显优于NB培养基对照组，且组间差异有统计学意义（P<0.05），在SSSL培养16 h后达到菌液浓度最高值，比NB培养基提前了4 h，说明SSSL更有利于金黄色葡萄球菌生长（表4）。

单增李斯特菌在SSSL培养基培养与NB培养基对照组生长速度比较相似，但在4、12、16 h单增李斯特菌在SSSL培养基中增菌效果要低于对照组，组间差异有统计学意义（P<0.05）（表5）。

2.3 SSSL培养基上选择性增菌效果的验证

肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌均能在SSSL培养基中良好生长，生长情况略好于NB培养基对照组，同时非目标菌受到了抑制，其中蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌和小肠耶尔森菌完全不能生长，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌在培养6 h和12 h受到了强烈抑制，非目标菌浓度远低于目标菌，降低了非目标菌对目标菌检测的干扰。NB培养基为对照（表6）。

3 讨论

微生物前增菌是影响微生物检测的重要因素，而微生物培养基为微生物提供了生长所需的营养物质和适合的环境条件，所以国内不少学者已经开展了对不同目标菌的增菌培养基研究，范媛媛等[12]对法国标准化协会推出的沙门氏快速检测AFRON改良法所用到的SX2液体培养基进行了评价，鼠伤寒沙门氏菌的生长率达到了0.94，而非目标菌大肠埃希杆菌的最高浓度为3CFU/mL，SX2液体培养基能快速促进目标菌生长，又能明显抑制非目标菌生长。赵广英等[13]用多种蛋白胨和酵母浸膏作为促进副溶血性弧菌增长的添加成分，得到了新的副溶血性弧菌增菌培养基。李晓琍等[14]通过金黄色葡萄球菌在Baird Parker琼脂平板上生长效果评价对7.5%氯化钠肉汤和10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤两种增菌培养基进行了比较，发现10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤选择性增菌效果更好。

本研究通过以改良的胰蛋白胨大豆肉汤为基础培养基，添加了丙酮酸钠、谷氨酰胺、磷酸吡哆醛、维生素B 12促进生长成分，4种目标菌在选择性增菌培养基培养8h后，菌体浓度能达到105～106 CFU/mL，培养12 h后，菌体浓度能达到107～108 CFU/mL。目标菌在SSSL培养基的生长速度总体上优于在营养肉汤NB培养基上，能满足后续试验检测要求。同时为了较好地抑制背景微生物，添加了氯化锂、亚碲酸钾、去氧胆酸钠和柠檬酸铁铵使非目标菌表现为完全不能生长或生长受到抑制，保证了SSSL培养基的选择性。

下一步可以探讨微生物培养基对于菌体的损伤修复和抑菌成分的拮抗，因为食品中的微生物往往受到加工过程中高温和低温的损伤，残留抗生素和抑菌化学成分的损伤，这些容易导致食源性致病微生物处于休克和假死状态，导致检测的检不出或结果的假阴性[15]。今后可以考虑把菌体细胞壁损伤的修复和本课题专注的快速增菌和抑菌成分吸附两个方面结合起来，从三个环节进行一体化研究，为食源性致病微生物各种检测方法提供更简便快捷的多场景通用型增菌培养基。◇

参考文献

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[5]GB 4789.10—2016.食品安全国家标准，食品微生物学检验，金黄色葡萄球菌检验[S].

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Preparation of Selective Co enrichment Medium for Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and Listeria monocytogenes

YAN Li1，XIAO Wen1，GUO Kun peng1，HE Juan1，LIU Zhuo ling2，YU Zheng2

（1 Hunan Institute of Food Quality Supervision and Inspection，Changsha 410117，China;2 Cooperative Innovation Center of Jiangnan University，Wuxi 214100，China）

Abstract： Objective To develop a selective co culture medium（SSSL）for Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and Listeria monocytogens. Method Single factor experiments were conducted to determine the composition and proportion of SSSL medium，and plate counting method was used to verify the bacteriostasis effect of SSSL medium. Result The SSSL medium formulation was established.After 8 hours of culture in SSSL medium，the concentration of target bacteria reached 105～106 CFU/mL，and the growth of non target bacteria was inhibited. Conclusion SSSL medium can be used for selective co growth of Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and Listeria monocytogenes.It is expected that SSSL medium can be combined with various detection methods to improve the detection rate and accuracy.

Keywords：Salmonella;Staphylococcus aureus;Shigella;Listeria monocytogenes;co enriched;selective medium