李洋 公旭彤 刘想 王加男 秦秀丽

【摘   要】 通过单因素及正交试验对苏云金芽孢桿菌菌剂的培养条件进行了优化。结果表明最适宜培养基配方为马铃薯粉20g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO42g/L，MgSO42g/L，pH8.0;最适培养条件为温度35℃，培养时间48h。

【关键词】 苏云金芽孢杆菌;菌剂;培养基;毒力测定

中图分类号：S312               文献识别码：A               文章编号：2096-1073（2020）09-0052-53

Optimization of Culture Conditions and Determination of Virulence of Bacillus Thuringiensis

LI Yang， GONG Xutong， LIU Xiang， WANG Jianan， QIN Xiuli*

（Jilin Agricultural Science and Technology University   Jilin， Jilin   132101）

[Abstract] The culture conditions of Bacillus thuringiensis agent were optimized by single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal medium formula was potato powder 20g/L， peptone 20g/L， KH2PO42g/L， MgSO42g/L， pH8.0. The optimum culture conditions were 35℃ and 48h.

[Key words] bacillus thuringiensis; bactericide; culture medium; virulence determination

在农作物生产中，经常会发生虫害，与化学农药相比，微生物杀虫剂已成为全球农药产业发展的重点[1-2]。其中苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其生长繁殖快，具有较强的适应性，易于人工培养，对直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目等多种农业害虫有很强毒杀作用，是目前世界上应用最广的细菌性杀虫剂。本试验对苏云金芽孢杆菌产芽孢的培养配方和培养条件进行优化，旨在为苏云金芽孢杆菌菌剂的生产提供理论依据。

1  材料和方法

1.1  试验材料

苏云金芽孢杆菌WY-197菌株，为吉林农业科技学院生物与制药工程学院微生物实验室保藏菌种;牛肉膏蛋白胨斜面试管培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂 20g/L，分装试管，常规灭菌后备用;液体菌种培养基：不加琼脂，装入250mL三角瓶中，每瓶装入量100mL，常规灭菌后备用;碳源基础培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L;氮源基础培养基：葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L;无机盐基础培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L。以上培养基调pH值为7.4-7.6。

1.2  培养条件的优化

培养温度设25、30、35、37、40℃ 五个水平，培养72h;培养时间设24h、36h、48h、60h、72h 五个水平;培养基初始pH值设6.5、7.0、7.5、8.0、8.5五个水平。对芽孢进行染色显微观察，对菌剂进行毒力测定，考查芽孢释放的最适培养温度、时间、pH值。

1.3  培养基质及配方的优化

碳源、氮源、无机盐的单因素比较：在供试碳源基础培养基中，分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、马铃薯粉、玉米淀粉各10g/L;在供试氮源基础培养基中，分别加入酵母膏、蛋白胨、大豆（煮熟粉碎）、鱼粉（粉碎）、麦麸（粉碎）各10g/L;在供试无机盐基础培养基中，分别添加FeSO4、KH2PO4、MgSO4各4g/L，以及FeSO42g/L+KH2PO42g/L、FeSO42g/L+MgSO42g/L、KH2PO42g/L+MgSO42g/L。

培养基质适宜配方综合比较：在碳源、氮源、无机盐单因素试验结果，设计L9（34）正交试验（见表1），配制9种培养基以得出最适培养基配方。

1.4  毒力测定[3]

从淘宝平台购得黄粉虫活体鲜活种虫以及饲料，用规格为长18cm×宽13cm×高6cm塑料盒为装虫容器，每个塑料盒内放50g饲料，喷施10mL的菌液，使菌液与饲料充分拌匀，然后放入20只幼虫，塑料盒上用纱布覆盖，在温度是20℃～25℃，暗光下饲养，同时以无菌水处理设空白对照，计算72h内幼虫死亡率，根据幼虫死亡率确定最适培养基配方和培养条件。

2  结果与分析

2.1  培养条件对菌剂毒力的影响

不同培养温度、培养时间及不同pH对菌剂毒力的影响结果分别见图1、图2、图3。图1结果表明：当培养温度为30℃时，喂饲昆虫的死亡为85%;当培养温度为35℃时，喂饲昆虫的死亡率最高达到91%;当培养温度为37℃时，喂饲昆虫的死亡为32%，当培养温度升高到40℃，几乎观察不到芽孢。说明当温度超过35℃后不利于芽孢的形成，当温度达到40℃时，不能形成芽孢;图2结果表明：随着培养时间的延长，涂片观察芽孢数量逐渐增多，喂饲昆虫的死亡率也在增加，菌剂培养48h时，喂饲昆虫的死亡率达到最高，培养时间60h以后，菌剂中芽孢的数量几乎没有增加，喂饲昆虫的死亡率没有升高;图3结果表明：随着菌剂中pH值升高，喷施饲料喂饲昆虫其死亡率逐渐升高，但在中性及偏酸性条件下，昆虫死亡率升高不明显，当pH值超过7.0时昆虫死亡率升高较快，当pH值为8.0 时昆虫死亡率最高，当pH值达到8.5时，昆虫的死亡率有所下降。

2.2  碳源、氮源、无机盐优化试验结果

对不同碳源、氮源、无机盐的菌液进行毒力测定的试验结果分别见图4、图5、图6。图4结果表明：以马铃薯粉和葡萄糖为碳源的菌剂，喷施后昆虫死亡率最高，随后依次是蔗糖>麦芽糖>玉米淀粉，由于马铃薯粉原料易得，比较适合于生产中选用;图5结果表明：以蛋白质胨为氮源的菌剂喷施饲料喂饲昆虫，昆虫死亡率最高，表明菌剂中芽孢的数量最多，其次为是酵母膏，随后依次为大豆>鱼粉>麦麸;图6结果表明：培养基质中含有KH2PO42g/L+MgSO42g/L两种无机盐的菌剂喷施饲料喂饲昆虫时，菌剂中芽孢的数量最多，昆虫死亡率最高，含有其他无机盐的菌剂昆虫的死亡率次序为KH2PO4+MgSO4>FeSO4+KH2PO4>FeSO4+MgSO4>KH2PO4>MgSO4>FeSO4。

2.3  芽孢形成最适培养基配方的优化试验结果

正交试验设计见表1，试验结果见表2，从表2可知：菌剂培养基配方的最佳组合为A3B3C2D2，即马铃薯粉20g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO42g/L，MgSO42g/L。从极差R可知，培养基中各组分对芽孢形成及菌剂毒力影响的排序为蛋白胨>马铃薯粉>MgSO4 >K2HPO4。

3  结果与讨论

本试验结果表明，苏云金芽孢杆菌WY-197菌株產芽孢适宜培养基的配方：马铃薯粉20g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO42g/L，MgSO42g/L，pH8.0;最适培养温度为35℃，培养时间为48h，在此条件下进行培养，菌剂产芽孢数量最多，毒力最强。微生物菌剂从实验室走向应用是一个复杂的过程，本试验所测得的菌剂毒力，是在实验室条件下所测得的，在农业生产中菌剂施用后，对菌剂毒力的影响因素更为复杂，还需要进行深入的研究和探索。

参考文献：

[1] 肖筠，黄世群，丁佶，等.微生物杀虫剂——苏云金杆菌（ Bt）[J]. 四川农业科技，2008（4）： 44-45.

[2] 唐韵.我国生物农药发展现状与选用指南[J]. 农药市场信息，2014（6）：52-57.

[3] 张玮玮，李红梅，弓爱君，等.Bt生物农药毒力效价检测方法综述[J].化学与生物工程，2009，26（11）：12-15.

[4] 杨航聪，金松松.苏云金芽孢杆菌MS7培养条件的优化[N].杭州师范大学学报（自然科学版），2013，12（6）：535-538.

[5] 郭慧慧.试验设计在苏云金芽孢杆菌培养基优化中的应用[J]. 闽东农业科技，2016（01）：19-23.

（编辑：李丹）