丁红映，田宇豪，李 青，杨佳怡，胡新喜，熊兴耀,2，秦玉芝*

(1.湖南农业大学园艺园林学院 /湖南省马铃薯工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

【研究意义】马铃薯(SolanumtuberosunL.)是茄科茄属一年生草本植物，具有极高的营养价值，是世界上仅次于水稻、小麦和玉米的世界第四大粮食作物，在我国种植区域广泛，面积和产量均居世界首位[1-2]。我国南方冬作区马铃薯种植时间主要在晚秋、冬季和早春，期间常常遭遇霜冻以及持续低温天气，影响幼苗正常生长，造成减产甚至绝收[3]。因此，研究马铃薯材料的耐寒性，选育耐寒性品种，是南方冬作区马铃薯产业发展的重要手段之一。【前人研究进展】 低温胁迫会导致植物细胞结构、成分及代谢过程与中间产物的一系列变化。因此，生理响应分析是研究植物耐寒性常见的手段。研究发现马铃薯在同等光合有效辐射下，净光合速率随环境温度的下降而降低，10 ℃条件下的马铃薯净光合速率与基因型耐寒性呈正相关[4]。植物代谢过程中产生的活性氧(ROS)动态平衡会因低温胁迫被打破，使得ROS含量急剧増加或者先上升后下降趋势，不同基因型石榴ROS含量增幅不同，且到达峰值的温度也不同[5-6]。环境温度变化显著影响细胞含水量。其中，不同低温处理过程中自由水/束缚水比值变化关注较多。普遍认为自由水/束缚水比值较低，细胞液浓度高，保水能力强，植物耐寒能力较强[7]。脯氨酸是一种亲水性有机溶剂，与细胞水势呈负相关。魏亮等发现马铃薯植株脯氨酸含量与耐寒性之间具有高度相关性，耐寒性越强的植株脯氨酸含量越高[8]。丙二醛(MDA)能够引发化学加成作用，使生物膜中的结构蛋白和酶发生聚合和交联，丧失了原有的结构和催化功能，抑制细胞保护酶活性和降低抗氧化物的含量，从而加剧膜脂过氧化[9]。MDA 含量越高，膜脂过氧化程度越高，说明膜受伤越严重。黄超等研究表明，甜瓜在4℃低温处理8h后，不同品种间的丙二醛含量达到极显著水平，随着胁迫时间增加，丙二醛含量升高，但其显著水平有所降低[10]。植物低温胁迫生理响应研究一直备受关注，但由于植物耐寒性途径的多样性与复杂性仍无法提出完整的耐寒机制。【本研究切入点】本研究通过对不同耐寒性马铃薯材料的抗氧化酶活性，渗透调节物质和膜脂过氧化3种生理途径中关键因子进行耐寒性关联综合分析，评价这些生理指标在马铃薯耐寒性特征的贡献率大小。【拟解决的关键问题】采用主成分分析、隶属函数和聚类分析法，综合评价16份马铃薯材料的耐寒性。

1 材料与方法

1.1 试验材料及其低温处理

试验于2018年10月初，在湖南农业大学马铃薯工程中心进行，供试的16份马铃薯材料：陇薯8号、陇薯7号、中薯11号、华彩1号、300046.22、冀张14号、acanle-6、中薯8号、acanle-4、396034.268、F170、黄麻子、E1、AV9、AV1、634777。组培苗扩繁，每一种资源5瓶，每瓶5～6株，在光照强度3200 lx，光周期为光照/黑暗(14/10 h)，温度为20～22 ℃的组培室，生长25 d，移栽于栽培盆中，置于光照强度为4000 lx，光周期为光照/黑暗(14/10 h)，温度为20～22 ℃的人工气候室，生长50 d。

将离体马铃薯功能叶片置于程序降温仪，胁迫温度为-3 ℃，胁迫时间为6 h。低温胁迫处理后的叶片，混合取样，测定各项生理生化指标，每个指标重复3次。同时，以正常生长温度(20 ℃)、胁迫时间为0 h为对照。

1.2 指标的测定与数据分析

过氧化氢酶(CAT) 活性、超氧化物歧化酶(SOD) 活性、过氧化物酶(POD) 活性参照李合生的测定方法[11]。游离脯氨酸(PRO)含量采用酸性茚三酮法，可溶性糖(SS)含量采用蒽酮比色法，可溶性蛋白(SP)含量采用考马斯亮蓝法，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法。每个指标重复3次。测试分析是根据试剂盒的说明(科铭，苏州)利用可见分光光度计测定分析。

耐寒系数和隶属函数参照谢季坚[12]的方法:

耐寒系数(%)=处理条件下的测量值/对照条件下的测量值×100 %

(1)

耐寒系数转换为隶属函数公式如下:

隶属函数u(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

反隶属函数u(Xij)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(3)

式中，u(Xij)第i个品种第j个指标的隶属函数值。Xij为耐寒系数，Xmin为参试品种中第j个指标耐寒系数的最小值、Xmax为参试品种中第j个指标耐寒系数的最大值。如果耐寒指标与耐寒程度呈正相关，用公式(2)计算，反之，则用公式(3)计算。

利用Microsoft Excel 2010进行数据处理，利用SPSS 22.0软件进行显著性分析、主成分分析、隶属函数、聚类分析。

2 结果与分析

2.1 马铃薯不同生化指标的影响及耐寒系数分析

根据1.2耐寒系数的计算公式，求出各单项指标的耐寒系数。由各单项指标的耐寒系数可看出，不同马铃薯材料，生理生化指标都发生了变化(表1)。分析过氧化氢酶(CAT)活性，超氧化物歧化酶(SOD)活性，过氧化物酶(POD)活性等抗氧化酶。其中，CAT活性耐寒系数“F170”的值最大，为1.663±0.244，“acanle-6”的值最小，为0.562±0.19；SOD活性耐寒系数“F170”的值也是最大，为5.926±0.041，“陇薯7号”最小，为0.582±0.005； POD活性耐寒系数“300046.22”的值最大，为1.923±0.035，“acanle-6”的值最小，为0.528±0.036。由表1可知，这3种抗氧化酶的耐寒系数极值存在显著性的差异(P<0.05)。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的最终产物，是膜系统受害的重要标志。MDA含量的耐寒系数“AV1”最大，为1.832±0.045，“acanle-4”最小，为0.745±0.067。

表1 低温胁迫下16个马铃薯材料生理生化指标的变化

分析渗透调节物质在低温响应中的变化，游离脯氨酸(PRO)含量耐寒系数“AV9”最大，为3.826±0.518 %，“634777”最小，为0.658±0.043，说明不同马铃薯通过PRO来提高对低温的胁迫的能力存在差异性；可溶性糖(SS)含量耐寒系数“AV1”最大，为4.533±0.306，“陇薯8号”最小，为0.429±0.03；可溶性蛋白(SP)含量耐寒系数 “黄麻子”最大，2.140±0.183耐寒性，“634777”最小，为0.542±0.097耐寒性。

2.2 不同马铃薯材料7个生化指标主成分分析

从表2可知，在相关系数矩阵中，CAT、SOD、POD活性，游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量7个单项指标间存在一定的相关性，造成7个指标间信息的交叉。不同的指标系数对不同材料的耐寒性的评价不尽相同。采用主成分分析法对各项进行综合评价。

表2 马铃薯幼苗耐寒性指标间的相关性

对16个马铃薯材料的CAT酶活性，SOD酶活性，POD酶活性，游离脯氨酸含量，可溶性糖含量，可溶性蛋白含量和丙二醛含量7个指标的耐寒系数进行主成分分析，由表3可知，将7个单项指标转化成7个相互独立的综合指标前4个综合指标(CI1-CI4)的贡献率分别是34.829 %，22.108 %，14.48 %，12.312 %，累计贡献率达83.729 %(大于80 %)，表明采用这4个相互独立的综合指标可以对不同马铃薯材料的耐寒性进行鉴定，具有较强的代表性。根据成分矩阵来看，在4个相互独立的综合的指标中，丙二醛(0.925)，SOD酶活性(0.757)，可溶性蛋白(0.717)，SOD酶活性(-1.07)活性指标占了较大的比重，SOD酶活性是综合指标2(CI2)和综合指标4(CI4)的关键因素，发生了信息间的重叠，所以可以将这3个指标看作是影响马铃薯耐寒性的关键因素。

表3 各综合指标的系数以及贡献率

2.3 不同马铃薯材料耐寒性综合评价

2.3.1 隶属函数分析 从表4可知，在低温胁迫下，综合指标U1中，“AV1”的值最大(1.000)，“中薯8号”最小(0)，说明在CI1这一综合指标上，“AV1”的耐寒性最强，“中薯8号”耐寒性最弱，同理，在CI2 这一综合指标上，“F170”的耐寒性最强，“300046.22”的耐寒性最弱；在CI3这一综合指标上，“华彩1号”的耐寒性最强，“acanle-6”的耐寒性最弱，在CI4 这一综合指标上，“AV9”的耐寒性最强，“冀张14号”的耐寒性最弱。综合评价得，“黄麻子”耐寒性最强，“634777”耐寒性最弱。

2.3.2 权重的确定 根据4个综合指标的贡献率的大小，计算得到4个综合指标的权重分别是0.416，0.264，0.173，0.147。

2.3.3 综合评价 根据公式，计算得到不同马铃薯材料的综合耐寒能力D值(表4)，“黄麻子”最大(0.667)，说明其耐寒性最强，“634777”最小(0.168)，其耐寒性最弱。根据D值对16份马铃薯材料的耐寒能力排序：“黄麻子”>“AV1”>“F170”>“AV9”>“华彩1号”>“陇薯8号”> “acanle-4”>“中薯11号”>“396034.268”>“300046.22”>“中薯8号”>“冀张14号”>“陇薯7号”>“acanle-6”>“E1”>“634777”。

表4 不同材料的综合指标值，权重，U(X)，D值以及综合评价

2.4 隶属函数和聚类分析

将16份马铃薯材料的CAT、SOD、POD活性，游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量主成分分析的D值，进行隶属函数和聚类分析(表5)，隶属函数法对试验材料进行排序，耐寒性鉴定的隶属函数度0.7≤u(x) ≤1为强耐寒；0.3 ≤u(x) ≤0.69 为中等耐寒；0.00≤u(x)<0.29为弱耐寒。强耐寒材料3份，包括“黄麻子”、“AV1”和“F170”，中等耐寒材料7份，其中“AV9”、“华彩1号”和“陇薯8号”排名比较靠前。弱耐寒材料6份，其中“63477”和“E1”耐寒性最差。聚类分析分成3类，见图1。鉴定出Ⅰ类(强耐寒)材料2份，包括“黄麻子”和“AV1”，Ⅱ类(中等耐寒)材料8份，分别为“F170”、“AV9”、“华彩1号”、“中薯8号”、“acanle-4”、“中薯11号”、“396034.268”、“300046.22”。Ⅲ类(弱耐寒)材料6份，分别为“中薯8号”、“冀张14号”、“陇薯7号”、“acanle-6”、“E1”、“634777”。

表5 马铃薯材料隶属函数和聚类分析耐寒性分级

图1 16份马铃薯材料耐寒性的系统聚类结果

3 讨 论

逆境导致活性氧的积累使自由基的产生与清除这一动态平衡打破，从而造成膜系统的损伤甚至瓦解，导致膜脂过氧化终产物 MDA 含量的增加，细胞膜系统是低温冷害发生的首要部位,低温引起的细胞器膜结构的破坏是导致植株寒害损伤和死亡的根本原因[17]。所以丙二醛的含量，在一定程度上代表了膜脂受伤害的程度，也能够反应植物耐寒性的强弱。在本研究中，丙二醛是马铃薯耐寒性的首要关键因子。植物的耐寒性是由多个基因控制的数量性状，采用单一的指标、单一分析方法难以准确评价植物的耐寒性[18]。本研究测定低温胁迫下16份马铃薯材料7个生化指标，采用主成分分析，隶属函数和聚类分析3种分析方法对研究材料的耐寒性进行了综合评价。研究结果认为二醛含量、可溶性蛋白含量和SOD活性可作为评价马铃薯耐寒性的重要参考指标，这3个指标涉及膜脂过氧化，抗氧化酶和渗透调节3种不同的生理响应过程，再次说明马铃薯耐寒性的复杂性。