符慧娟，李星月，李其勇，朱从桦，向运佳，张 鸿

(1.四川省农业科学院植物保护研究所/农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，四川 成都 610066；2.四川省农业科学院，四川 成都 610066)

【研究意义】油菜是我国重要的油料作物之一[1]。四川作为我国油菜的主产区和优势区，随着长江中下游地区油菜播种面积的减少，四川油菜种植优势更加凸显。近年来，为追求高产量和高收益，农民在种植过程中盲目过量的施加肥料，造成土壤酸化严重、土传病害加剧，因此，既要保证油菜免遭严重病虫害，还要稳定油菜原有的品质和产量显得尤为重要。光合细菌(Photosyntheticbacteria，PSB)属于原核生物界薄壁菌门中的厌氧光合菌纲，它大量存在于自然水域的厌氧层上部，是一类以光能和低级有机物作为能源来源进行不放氧光合作用的微生物，它可以产生促进生长因子进而提高土壤肥力，加强植物光合作用，并且光合细菌菌体内含有多种维生素、丰富的蛋白质和氨基酸、辅酶Q10等多种生理活性物质，无毒、安全[2-3]。【前人研究进展】当前，光合细菌的研究主要集中在有机废水的处理、动物饲养领域、光合细菌制氢及光合细菌生产高性价比有机物四方面[4-7]。除此之外，光合细菌对土壤的生物固氮能力有巨大的作用，它与其他固氮菌的共存可大大提高土壤肥力，作为底肥及叶面肥时可改善土壤板结、盐化等问题，帮助植物根系发育[8]。在植物抗性和农药残留、病毒等各种病原物产生有效抗性，可在一定程度上起到植物抗病害作用，另外，它还可以通过氧化或降解残留在土壤中的农药、硫化氢及胺类等有毒化合物，减少有害物质在土壤中的沉淀累积，对土壤起一定解毒作用，避免或降低农作物中有害物质的积累，保证农副产品的安全[9-10]。硅肥是一种新型肥料，它能够为植物提供其需要的有益元素，对油菜的农艺性状等也存在较大的影响，能显著提高油菜产量和理论产油量[11]。【本研究切入点】近些年来，领域内各学者对光合细菌持续保持着一定研究热度，而针对硅肥与光合细菌分别及混合施用对作物产量等影响的效果对比研究较少，本研究设置硅肥和光合细菌组合施用，通过比较分析硅肥和光合细菌对油菜的土壤养分、土壤酶活性、油菜植株性状和油菜根肿病发病率的影响，运用Illumina高通量测序技术研究光合细菌处理下油菜根际土壤的真菌群落结构，探讨光合细菌对油菜根际土壤的真菌群落结构的影响。【拟解决的关键问题】为改善油菜土壤环境、提高油菜品质与产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验概况

供试油菜品种为四川的油菜主栽品种川油36号。供试光合细菌为红假单胞菌属Rhodopseudomonasspp.，浓度为≥30亿cfu/mL；供试硅肥为迈乐土壤调理剂(SiO2≥ 20 %)，由山西迈乐肥业有限责任公司提供。试验地前作夏玉米，肥力中等，土壤类型为紫色土，土壤有机质含量为1.63 %，碱解氮为25.44 mg·kg-1，有效磷为6.78 mg·kg-1，速效钾为86.64 mg·kg-1。

1.2 试验方法

试验于2017-2018年在四川省广汉市进行，采用单因素随机区组试验设计，3次重复。试验设置3个处理和一个空白对照处理，其中，GB为施用240 L·hm-2光合细菌处理，Si为施用600 kg·hm-2硅肥处理，GB+Si为施用240 L·hm-2光合细菌、600 kg·hm-2硅肥的混合处理，CK为未施用硅肥和光合细菌的空白对照处理，底肥采用15∶15∶15的氮磷钾复合肥一次性施用，平均施用量为750 kg·hm-2。

播种期9月29日，采用直播方式，试验密度为12万株·hm-2，每小区24 m2(4 m×6 m)，小区间隔0.5 m，撬窝点播，行距20 cm，窝距20 cm。试验区四周设宽1 m走道，走道外围设有保护行。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤养分测定 油菜播种未施用底肥前，采用五点取样法对试验田耕作层进行取样，测定全氮、碱解氮、硝态氮、铵态氮、有效磷、速效钾、有机质含量。全氮用微量凯氏定氮法；有机质用重铬酸钾容量法；碱解氮用碱解扩散法；铵态氮用2 mol·L-1KCl浸提-靛酚蓝比色法；硝态氮用酚二磺酸比色法；有效磷用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-钼锑抗比色法；速效钾用1 mol·L-1NH4OAc浸提-火焰光度法。

于油菜成熟期，采用五点取样法对试验区耕作层进行取样，测定土壤pH值、土壤有机质和土壤碱解氮，土壤pH值用PHS-29A型酸度计(上海第二仪器厂生产)测定，水∶土=2.5∶1。

1.3.2 土壤酶活测定 采用高锰酸钾滴定法测定土壤过氧化氢酶活性、3,5-二硝基水杨酸比色法测定土壤蔗糖酶活性、利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N含量确定土壤脲酶活性、酸性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定、3,5-二硝基水杨酸比色法测定纤维素酶。

1.3.3 植物指标测定 经济性状及产量：到成熟期时，每小区取5株样进行室内考种，考察项目包括有效分枝高度、株高、茎粗、有效分枝数、单株有效角果数、30角果粒数、千粒重、种子水分；每小区单打单收晒种测定实际籽粒产量。

1.3.4 土壤总DNA 的提取及16S rRNA基因的PCR 扩增土壤总DNA 基因组采用DNA 提取试剂盒进行提取。真菌菌群用ITS(Internal transcribed spacer)序列高通量测定，遵循Illumina测序仪文库构建方法，以ITS3-4 为目标DNA区域，采用扩增引物为：ITS1：(5′-TCC GTT GGT GAA CCA GCG G-3′)，ITS4: (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。PCR结束后，PCR产物进行琼脂糖电泳检测。真菌PCR产物和正常扩增片段在400 bp以上的PCR产物，选用0.6倍的磁珠(AgencourtAMPure XP)处理，真菌PCR产物和其他扩增片段小于400 bp的PCR产物，选用0.8倍的磁珠处理。利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以方便按照1∶1的等量混合后测序。等量混合时，每个样品DNA量取10 ng，最终上机测序浓度为20 pmol。将样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司在IlluminaMiSeq平台进行高通量测序。

1.4 数据处理与统计分析

数据处理及相关分析采用Excel 2007 软件进行，相关性分析采用SPSS17.0 软件进行。

2 结果与分析

2.1 土壤pH值、碱解氮、有机质含量在光合细菌和硅肥互作下的表现

由图1可以看出，通过对成熟期油菜土壤pH、土壤碱解氮和土壤有机质含量的测定发现，3种处理对油菜土壤pH值均无显著影响，Si、GB+Si 2种处理仅能够略微提高油菜根系土壤pH，但与对照相比没有显著差异；Si处理能够显著提高土壤碱解氮含量，而GB和GB+Si处理对土壤碱解氮含量无显著影响；GB和GB+Si处理显著增加土壤有机质含量。

CK：空白对照；GB：光合细菌240 L·hm-2；Si：硅肥600 kg·hm-2；GB+Si：光合细菌240 L·hm-2+硅肥600 kg·hm-2

2.2 土壤酶活力在光合细菌和硅肥互作下的表现

如图2所示，通过对成熟期油菜的土壤过氧化氢酶(S-CAT)、土壤蔗糖酶(S-SC)、土壤脲酶(S-UE)、土壤酸性磷酸酶(S-ACP)和土壤纤维素酶(S-CL)的测定发现，各处理下的土壤酶活性差异明显。GB、GB+Si处理对S-CAT活力有较优增益效果；S-SC和S-UE在GB+Si处理时活力得到了明显升高，其中S-UE的活力值范围趋近于760μg/d/g；S-ACP活力在GB和Si处理时有明显提升，其中GB处理的影响更为显著；Si单独处理下，S-CL活力显著提升，其余处理对S-CL活力的影响不显著。

CK：空白对照，GB：光合细菌240 L·hm-2，Si：硅肥600 kg·hm-2，GB+Si：光合细菌240 L·hm-2+硅肥600 kg·hm-2

2.3 油菜根肿病发生率在光合细菌和硅肥互作下的表现

各个处理的油菜根肿病发病率有显著差异(图3)，与对照相比，光合细菌单独施用或同硅肥混合施用，都能有效降低油菜的根肿病发病率，而硅肥单独使用，并没有抑制根肿病发病率的作用。光合细菌有抑制根肿病病原菌侵染油菜根系的作用，而硅肥本身不能起到降低根肿病发病率的效果，只能说辅助改善油菜的根际土壤环境，提高植株的生理抗性。

CK：空白对照，GB：光合细菌240 L·hm-2，Si：硅肥600 kg·hm-2，GB+Si：光合细菌240 L·hm-2+硅肥600 kg·hm-2

2.4 油菜产量、经济性状在光合细菌和硅肥互作下的表现

本试验共4个处理，分别测定了试验区油菜的有效分枝高度、株高、茎粗、有效分枝数(一次)、有效分枝数(二次)、单株有效角果数、30角果粒数、千粒重、种子水分、小区产量十项指标，如表1所示，油菜有效分枝高度、株高、茎粗等指标在各个处理的影响均不显著。在GB处理时，油菜植株单株有效角果数、小区实测产量两项指标明显高于空白对照及其他处理；Si处理下油菜植株株高、有效分枝数(二次)两项指标明显高于空白对照处理及其余处理，但小区实测产量优势不突出；GB+Si处理下油菜植株30角果粒数、千粒重等指标相较于空白对照处理有明显优势，小区实测产量略高于CK对照处理。

表1 不同处理对油菜植株各指标的影响

2.5 光合细菌对油菜根际细菌群落在属分类水平的影响

光合细菌的施入对油菜根际细菌群落在属的分类水平上有显著的影响(表2和图4)，光合细菌提高了固氮菌-芽单胞菌属Gemmatimonas、植物根际促生菌-假单胞菌属Pseudomona的种群数量和比例，对油菜根际微生态环境有明显的改良作用，不仅有利于根系的健康生长，并能利用生防菌优势抑制土壤中的植物病原菌，减少油菜的土传病害发病率。

CK为空白对照，GB为光合细菌处理240 L·hm-2

表2 光合细菌对油菜根际细菌群落在属分类水平的影响

3 讨 论

3.1 光合细菌和硅肥对油菜土壤肥力和酶活力的影响

光合细菌可以提高土壤肥力，降低土壤酸碱度[12]。本研究结果显示，光合细菌处理下有机质含量得到显著提高，碱解氮含量有微小的提升，但土壤pH降低；硅肥处理下，pH、有机质含量得到提高，碱解氮含量显著升高；光合细菌和硅肥分别显著提高了有机质和碱解氮含量，将其混合施用后，pH、碱解氮和有机质含量均得到提升，土壤肥力呈现了更综合和全面的提升，说明光合细菌和硅肥搭配使用能够有效促进相互之间作用的发挥。光合细菌还能产生很多有价值的有机物，如单细胞蛋白、类胡萝卜素等[4]。同时，施用适量的光合菌肥数量可以较好的促进酶活，促进植物生长。有研究表明，复合菌剂处理促进了过氧化氢酶、脲酶、酸性磷酸酶、纤维素酶的活性得到升高[13]。本研究结果得出，S-CAT、S-SC、S-UE、S-ACP 4种酶活力在施用光合细菌后都有提升，其中S-CAT、S-ACP的酶活力呈现显著增加；S-CAT、S-SC、S-UE、S-ACP、S-CL的酶活力在硅肥处理下均有所提高，但仅对S-CL的酶活力影响达到了显著水平；光合细菌和硅肥混合施用处理下，S-CAT、S-SC、S-UE的酶活力比分别单独施用光合细菌和硅肥的提升效果更佳，但在对S-ACP和S-CL的活力影响为负。

3.2 光合细菌和硅肥对油菜产量、经济性状的影响

有研究显示，通过光合菌剂沾根或喷施处理，能够促进水稻生长发育、促进水稻灌浆、增加稻米蛋白质含量、提升水稻品质[14]。在同基础之下，采用光合细菌喷施之后显著提高了蔬菜的产量[15]。本文通过研究光合细菌和硅肥耦合作用下对油菜产量、经济性状的影响，结果显示，GB、Si、GB+Si处理下油菜千粒重和小区实测产量相较于空白对照处理有显著优势，种子水分含量小于CK处理，千粒重、种子水分、小区实测产量对油菜产油量存在影响，千粒重、小区实测产量与油菜产油量正相关，种子水分与油菜产油量负相关，因此GB处理下，油菜千粒重、种子水分、小区实测产量相较于其余处理呈显著提高水平，油菜的产量及产油量都具有明显优势。

3.3 光合细菌和硅肥对油菜根肿病发生率的影响

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分[16]，光合细菌具有明显抑制真菌增殖的作用，它通过提高放线菌数量抑制真菌增殖，改善土壤环境，使根系活力增强促进其对营养元素的吸收，减少土传病害的发生。有研究表明，PSB发酵液中含有多种生理活性物质和微生物菌群，这些生理活性物质能够激活植物细胞的活性，提高细胞的光合作用能力，微生物菌群可代谢生成多种酶和有机酸，促进土壤中有益菌的增加及各养分分解、改善土壤结构和土壤理化性质[17-19]。本研究结果显示，光合细菌单独或混合施用情况下，均能够降显著低油菜根肿病发病率，推测其原因：光合细菌通过提高有益菌的数量，调节土壤环境，有效改善油菜根际土壤菌群结构，降低油菜根肿病的发生几率。

4 结 论

光合细菌和硅肥均对土壤养分、土壤酶活性及油菜的产量、经济性状等都产生了有益的影响，并有效减低了油菜根肿病的发病率，对油菜产量、产油量和根肿病抑制效果的影响由高到低排序为：光合细菌>光合细菌+硅肥>硅肥>空白对照。从土壤微生态角度出发，光合细菌促进了有益菌的生存和繁殖，提高了固氮菌、植物根际促生菌的数量，改善了油菜根际微生态环境、优化了根际土壤真菌群落结构。本试验结果表明光合细菌与硅肥在增强油菜土壤肥力、抑制油菜土传病害方面具有潜力，可以在油菜健身栽培与绿色生产中的进一步推广应用。