李 勇，逄 涛*，郑昀晔,，牛永志，师君丽，马文广,，卢秀萍

(1.云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650021；2.玉溪中烟种子有限责任公司，云南 玉溪 653100)

【研究意义】种子质量是种子潜力的综合表现，种子具有优良品质是保证发芽快速及出苗整齐和健壮的先决条件[1]。高质量种子具有明显的生长优势和生产潜力，对提高种子耐藏性和田间成苗率、抵抗苗期逆境、节省播种量、增加产量等具有重要意义[2-3]。种子质量与种子成熟度直接相关，只有成熟度达到要求的种子才有可能具有高活力[4]。【前人研究进展】目前，烟草种子成熟度主要依据蒴果和种子的颜色判断，种子质量主要依靠发芽势和发芽率判断，在生化、分子方面的成熟机理研究尚未深入开展，烟草种子成熟度评价的内在指标缺乏[5]。烟草种子授粉后第27～33天采收的种子发芽率均可达90 %以上，但这期间不同采收时间的种子后期的活力和耐贮藏特性却大不相同。因此，有必要在发芽率指标的基础上开发其他指标(如种皮叶绿素荧光[6])指示种子成熟度和质量。蛋白质在种子形成、发育到长成幼苗的过程中均起着十分重要的作用[7]。蛋白质组学是一种从整体水平上研究蛋白质组成和调控规律的方法[8-9]。种子的蛋白组学分析是研究种子发育过程中基因表达的重要手段，但目前烟草种子蛋白方面的研究只有蛋白提取检测方法研究[10]和个别蛋白在烟草种子发育过程中变化规律研究[11]的报道，未见烟草种子发育蛋白组学研究的文献报道。【本研究切入点】以同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)为基础，对烟草种子成熟过程蛋白组的变化开展研究，筛选烟草种子成熟过程中的关键差异蛋白。【拟解决的关键问题】为开发指示种子成熟度和质量的分子标记提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 实验装置、试剂及材料

色谱纯甲醇购买于德国Merck公司，实验用水由Millipore超纯化系统制备。

AB SCIEX nanoLC-MS/MS(Triple TOF 5600 plus) (美国SCIEX公司)，配ChromXP C18分析柱(15 cm × 75 μm × 3 μm，美国SCIEX公司)，SB-50D超声波提取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，MILLI-Q纯水机(德国MILLIPORE公司)，Centrifuge 5804R离心机(德国Eppendorf公司)，CP2245分析天平(感量0.0001 g，德国Sartorious公司)，涡旋混匀器(荷兰Breda公司)，CryoMill 磨样机(德国Retsch公司)，CHRIST ALPHA 1-2/LD-Plus冻干机(德国Marin Christ 公司)。

使用的种子材料为烤烟品种云烟97。

1.2 蛋白提取及定量

取2 g烟草种子，液氮下磨成干粉(磨样频率30 Hz，磨样时间30 s)，用200 μl的四乙基溴化铵裂解液(TEAB)溶解；超声破碎15 min，离心(12 000 r/min)20 min取上清；加入4倍体积的冷丙酮(含10 mmol/L DTT，-20 ℃)沉淀2 h；离心(12 000 r/min)20 min，收集沉淀；加入800 μl的冷丙酮；离心(12 000 r/min)20 min，收集沉淀于室温下放置5～10 min，自然挥发掉残留溶剂后存于-80 ℃备用。总蛋白浓度用Bradford方法测定。

1.3 蛋白酶切、除盐和标记

取1 mg/mL蛋白溶液100 μl，加入50 mmol/L NH4HCO3500 μl，加入2 μg Tryspin酶液，37 ℃过夜；取上述酶解液，加入等体积的0.1 % 甲酸酸化酶解液；取出Strata-X C18柱用1 mL甲醇活化，加入1 mL 0.1 % 甲酸平衡；连续过3次将上述酸化后的酶解液加入到Strata-X C18柱子中；加入1 mL 清洗液(0.1 % 甲酸+5 %乙腈)，清洗2次；取1个新的离心管，往Strata-X C18柱子中加入1 mL洗脱液(0.1 %甲酸+80 %乙腈)洗脱1次，收集洗脱液；冻干后用20 μl 0.5 M TEAB复溶。蛋白标记方法参考Itraq 8-plex reagent kit 说明书。

1.4 色谱质谱分析条件

色谱分析条件：色谱柱为ChromXP C18(15 cm × 75 μm × 3 μm)；A相为5 %乙腈水溶液添加0.1 %甲酸，B相为95 %乙腈水溶液添加0.1 %甲酸。线性梯度洗脱条件：0～65 min，B相由5 %上升至30 %，65～70 min，B相升至50 %，70～80 min，B相升至80 %，并维持5 min，85～85.1 min，B相降至5 %，并维持10 min；进样量，5 μl。

质谱分析条件：采用正离子模式采集，采集范围300～2200 m/z，采集频率5 Hz。

1.5 蛋白质鉴定和定量

使用ProteinpilotTMV4.5进行蛋白鉴定并对鉴定结果进行人工过滤，将置信度大于95 %且至少包含一个特征肽段的蛋白设为可信蛋白，不符合该条件的蛋白不予统计；对于鉴定的肽段，置信度大于95 %的被认为是可信肽段，不符合该条件的肽段不予统计。

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段种子萌发率

通过对授粉后不同阶段的烟草种子进行不同时间的萌发实验(图1)，发现授粉后第14天的种子完全不能萌发，授粉后第27和29天的种子在萌发14 d后基本达到成熟种子的萌发率，但相对成熟种子其萌发明显滞后，而授粉后第31天的种子萌发率最高，是活力最高的成熟种子。

图1 烟草种子在不同发育阶段的萌发率

2.2 蛋白鉴定结果统计

授粉后第14、21、23、25、27、29、31、33天等8个时间节点种子样品经液相色谱串联质谱检测到的所有二级谱图数为269 818个，其中解析的二级谱图数为83 852个，鉴定肽段数为14 316个，鉴定蛋白数为2852个。特征肽段统计结果显示，所鉴定的2852个蛋白中1973个蛋白至少包含2个特征肽段，占总蛋白数的69.18 %。对所鉴定的肽段进行长度分析，结果表明所鉴定的多肽平均长度为13.48个氨基酸，处于肽段长度合理范围。蛋白鉴定覆盖度分析表明，鉴定覆盖度在0 %～10 %范围内的蛋白质所占比例为35.80 %，覆盖度在10 %～20 %范围内的蛋白占25.53 %，覆盖度大于20 %的蛋白占38.67 %，所有蛋白的平均覆盖度为20.07 %，这组指标与目前已报导的iTRAQ方法检测蛋白质组研究中蛋白覆盖度相似[12-13]。对于一个鉴定到的蛋白质，包含支持该蛋白的肽段越多，该蛋白的可信度就越高。实验中符合标准的蛋白质鉴定覆盖度表明鉴定结果的准确性较高。

2.3 差异蛋白筛选

以授粉后第14天的蛋白表达水平作为对照，分别对比第21、23、25、27、29、31、33天种子的差异表达蛋白，结果显示在第21～27天随着烟草种子发育差异表达蛋白数量逐渐增多，在第27～31天趋于稳定，而第31～33天差异表达蛋白数量迅速回落(表1)。这一结果与上述烟草种子不同阶段的萌发率十分吻合，说明烟草种子成熟过程中，授粉后21～27 d可能是积累种子萌发所需结构蛋白和功能蛋白的关键阶段，种子萌发率稳定上升，而27～31 d则可能是由功能蛋白调控代谢配置的阶段，种子萌发率略有浮动。进一步对7组样品间的差异表达蛋白进行聚类分析，从蛋白表达聚类看，蛋白整体表达量随种子成熟过程逐渐变化，从样本聚类看，授粉后31 d与29、33、27 d均有较大差异(图2)。

表1 不同发育阶段烟草种子差异蛋白统计

行代表蛋白聚类，列代表样品聚类。所有定量数据经方差均一化处理

2.4 差异蛋白功能分析

为进一步研究烟草种子发育过程不同阶段蛋白功能的响应，对每组样品的差异表达蛋白进行相关基因功能注释(gene ontology,GO)分析。结果显示：授粉后第21和23天的差异表达蛋白显著富集的功能都包括抗氧化活性、醛酮还原酶活性、结构分子活性等；授粉后第25、27、29天，差异表达蛋白显著富集的功能则出现了酶抑制剂活性、作用于NAD和NADP的氧化还原酶活性、肽链内切酶抑制剂活性、碳-碳水解酶活性等；授粉后第31、33天，差异表达蛋白显著富集的功能又增加了核苷激酶、核苷酸激酶等活性。由此可知，种子发育过程中其蛋白功能发生阶段性变化，早期主要是执行种子形成的结构功能，中期主要负责种子生命活动的生化反应，而后期主要维持遗传物质的动态平衡和稳定。

2.5 种子成熟度标记蛋白筛选

种子成熟度是种子品质的重要保障，只有适熟种子的发芽势、发芽率和耐储藏性等指标才会最优。而通过外观判断成熟度以指导采收常会出现主观判断失误的情况，因此有必要在外观判断的基础上开发成熟度相关分子标记。实验共筛选出4个相关差异蛋白，他们在适熟期(授粉后第31天)之前表达量持续上升并在适熟期达到最高，随后表达量急剧下降(图3)。这些蛋白经进一步确认后可以单独或组合起来开发相关定量检测试剂盒，作为指示种子成熟度和质量的分子标记。

图3 烟草种子发育过程中相关蛋白表达情况

3 讨 论

实验共检测到269 818个肽段二级质谱图，解析的二级谱图数为83 852个，谱图鉴定率为31.08 %，该鉴定率虽已达到同类研究的正常水平(如研究报导水稻种子应用iTRAQ技术总共鉴定2711个蛋白[14]，芥蓝种子应用iTRAQ技术总共鉴定1532个蛋白[15])，但仍有69.92 %的谱图信息未被解析。原因之一是种子样品中蛋白含量差异很大，高丰度蛋白在检测中会干扰低丰度蛋白的检出，而低丰度蛋白通常二级质谱图信号较弱、谱图不完整，因此无法很好的进行谱图匹配解析。其二是由于烟草种子蛋白组学研究较少，蛋白数据库中没有完整的待解析肽段的标准谱图记录，因此部分肽段无法解析。谱图鉴定率低是蛋白组学研究面临的共性问题，有待检测技术的不断发展和数据库的不断完善。

4 结 论

通过蛋白组学分析表明，烟草种子在发育的不同时期表达蛋白的功能不同，前期表达的主要为种子形成结构功能相关蛋白，中期主要为负责种子生命活动的生化反应相关蛋白，后期主要为维持遗传物质动态平衡和稳定相关蛋白。研究筛选出6个相关蛋白，它们在种子发育前期表达量不断上升并在适熟时期表达量达到最高，随后表达量急剧下降。这些蛋白经进一步确认后可作为指示种子成熟度和质量的分子标记。