陈绮，雷文平，肖茜，姚慧，罗洁，刘成国，周辉

(1. 湖南农业大学 食品科学技术学院，长沙410128；2. 湖南省食品科学与生物技术重点实验室，长沙410128；3. 湖南南山牧业有限公司，湖南城步422512）

0 引 言

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB) 是一类能在生长代谢的过程中利用碳水化合物发酵产生乳酸的细菌，在自然界分布广泛，种类繁多，截至目前为止共有23 个属，200 多个种，菌株不计其数[1]。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一种糖类高聚物的总称[2-3]。乳酸菌胞外多糖可以作为一种天然的食品添加剂，改善食品黏稠度、质地和风味等[4]，因此被广泛应用于食品、医药等领域[5-7]。乳酸菌EPS 能够赋予牛乳独特的质地与口感，同时能够增加发酵乳制品的粘稠度减少乳清析出[8]。

产胞外多糖乳酸菌与发酵剂协同发酵乳制品，旨在改善乳制品质地和口感，并利用乳酸菌产生的胞外多糖，改善乳制品黏度，增加乳制品的安全性。将产胞外多糖菌珠Y5 与不产胞外多糖的LB、ST 菌株按照2%接种量接种到牛乳中，结果表明菌株Y5 的乳清析出量减少，证明产胞外多糖的乳酸菌能够提高产品的粘稠性[9]。

本研究以产胞外多糖植物乳杆菌XN1904E 为研究对象，将其与直投式发酵剂协同发酵组、发酵剂单独发酵组和植物乳杆菌XN1904E 单独发酵组进行发酵特性研究，测定发酵乳的多糖含量，并利用气相色谱-质谱连用技术对各组发酵乳制品进行风味分析，该研究为开发利用产胞外多糖乳酸菌资源提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种，植物乳杆菌XN1904E 由本实验室分离保存。MRS 肉汤培养基，广东环凯微生物科技有限公司；琼脂，Biosharp，葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；蔗糖，国药集团化学试剂有限公司；MRS 固体培养基：MRS 肉汤培养基中添加琼脂15.0 g；MRS-S 液体培养基: MRS 肉汤培养基中的葡萄糖20 g 改为5 g，再加蔗糖50 g；直投式发酵剂，北京川秀国际贸易有限公司；脱脂乳粉，澳优乳业（中国）有限公司；浓硫酸，国药集团化学试剂有限公司；苯酚，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（PUCHUN 型），上海精密科学仪器有限公司；生化培养箱（GZ-400-S 型），韶关市广智科技设备有限公司；双人单面垂直净化工作台（SW-CJ-2D 型），苏州博莱尔净化设备有限公司；超级恒温水浴锅（601 型），金坛市医疗器厂；冷藏柜（SC-320C 型），青岛海尔股份有限公司；气质联用仪（GCMS-QP2010 型），岛津企业管理（中国）有限公司；数显黏度计（NDJ-8S），上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的活化

取-80 ℃保藏的菌种冷藏至室温后，按5%的接种量接种于装有250 mL MRS 液体培养基的500 mL 锥形瓶中中，37 ℃培养24 h，活化两代后备用。

1.3.2 产胞外多糖植物乳杆菌（XN1904E）发酵特性研究

（1）菌种的驯化。

菌种扩大培养：将植物乳杆菌XN1904E 分别接种于MRS 液体培养基中，37 ℃扩大培养24 h，得到菌种的扩大培养液。

菌种驯化：将上述活化后菌液按照50%接种量（v/v）接种于10 mL 无菌的脱脂乳中37 ℃培养24 h，得到接种乳，再按照20%接种量（v/v）将接种乳接入到10 mL无菌脱脂乳中培养；之后每次驯化按照5%逐渐减少接种乳的添加量，增加无菌脱脂乳的量，控制总驯化次数为3～5 次；得到驯化好的菌种，其中菌种的含量控制在107～109CFU/mL[10]。

（2）发酵乳的制备。

参照方法[11]基础上有所调整，12%脱脂复原乳→预热(65～70 ℃)(混合均匀→杀菌(90～95 ℃，10 min) →冷却(41～43 ℃) →接种各试样组发酵剂（复配组；发酵剂组；XN1904E 组）接种量为3%→发酵(41 ℃，pH4.5 为发酵终点) →冷却后熟(4～6 ℃放置12 h) →成品待测。

1.3.3 发酵乳pH 值和滴定酸的测定

（1）采用数显pH 计测定发酵乳的pH 值。

（2）滴定酸度的测定：GB 5413.34-2010，食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定[14]。

1.3.4 发酵乳黏度的测定

将发酵乳置于室温（25 ℃）一段时间后，采用数显黏度测定仪测定发酵乳的黏度，参数设定为25 ℃，3#转子进行测定，其中转子转速15 r/min、扭矩10%～100%、测定时间30 s，每个样品平行做3次。

1.3.5 发酵乳多糖含量的测定

(1) 样品处理。准确吸取1.3.2 -（2）中制备的发酵乳10 g，加入60 mL 无水乙醇，使乙醇体积分数达到80%，使用旋涡混合器使其充分混合，4 500 r/min 离心5 min，弃去上清液，重复上述步骤三次得到沉淀，将其放置恒温干燥箱中低温（40 ℃）烘干，残渣用水溶解并定容到500 mL，备用。

(2) 样品多糖含量的测定。参照的黄承敏等[13]方法，采用苯酚-硫酸法测定发酵乳中多糖的含量。

1.3.6 发酵乳风味成分的测定

采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（SPME-GC-MS）对1.3.2 -（2）中制备的发酵乳进行风味成分分析。

（1）样品萃取方法。称取按1.3.1-（2）所制备发酵剂组、复合组和XN1904E 组发酵乳样品各1 g，分别置于15 mL 萃取瓶，在50 ℃温度条件下处理30 min,在70 ℃条件下用老化好的萃取头顶空吸附45 min，再插入GC-MS 进样口解吸1 min，拔出萃取头进行GC-MS分析。

（2）GC 条件。 DB-WAX 毛细管色谱柱（30 m 色谱柱（行萃取，0.25 μm）；进样口温度为250 ℃；柱箱升温程序：初温35 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min 的速度升温至200 ℃，再以20 ℃/min 的速度升温至最终温度250 ℃，保持5 min；载气为氦气He，流速为1 mL/min；进样采用自动分流方式进行，分流比10:1[12]。

（3）MS 条件。EM 电离源，离子源温度为250 ℃；接口温度为200 ℃；检测电压为1kV；质量扫描范围m/z为35～400。

1.4 数据统计

采用Excel 2010 软件进行数据分析，显著水平P＜0.05，并以Origin Pro 2018统计软件作图。

2 结果与分析

2.1 发酵特性测定结果

2.1.1 发酵乳pH 值的测定结果

三组发酵牛乳的pH 变化情况见图1。三组发酵乳起始pH 基本相同，均在6.50 左右。在发酵过程中，发酵剂组和复配组发酵乳样品的pH 值均随着时间的延长显著下降（P＜0.05），9 h 时发酵剂组和复配组的pH 分别达到了4.275、4.316。pH 值均降至4.5 以下，达到发酵酸乳生产的最终pH 值的要求[16]。9 h 之后发酵剂组和复配组发酵乳样品的pH 值呈缓慢下降趋势。XN1904E 单独发酵组在发酵9 h 时的pH 值6.193 ，此时XN1904E 单独发酵组的酸乳未能达到酸乳的国家标准，说明植物乳杆菌XN1904E 在发酵前期产酸能力弱。然而随着后熟时间的延长，XN1904E发酵乳呈显著下降趋势，说明植物乳杆菌XN1904E在后熟阶段产酸能力增强，可能是发酵前期植物乳杆菌XN1904E 生长繁殖缓慢导致分泌的有机酸较少。

图1 发酵乳发酵过程中pH值的变化

2.1.2 发酵乳滴定酸的测定结果

滴定酸度能够反映发酵乳中的酸性物质可能产生的全部氢离子的总量，因此，研究滴定酸度可更好的了解不同发酵条件下的发酵乳的产酸情况[14]。由图2 可知，滴定酸度与pH 值的结果一致，发酵9 h 后发酵剂组和复配组发酵乳样品的滴定酸分别为77.731oT、79.085oT ，此时两组的滴定酸度都超过了70oT，均达到乳酸菌发酵乳生产的最终酸度要求[16]，而此时菌株XN1904E 单独发酵的酸度仅为24.889oT。且24 h时，复配组发酵乳样品的滴定酸比发酵剂组高7.4%，可能是植物乳杆菌XN1904E 产生胞外多糖可促进直投式发酵剂利用糖类转化为有机酸[15]。

图2 发酵乳发酵过程中滴定酸的变化

2.1.3 发酵乳黏度的测定结果

各发酵乳的黏度测定结果见图3。，在发酵过程中，0～3 h 三个组别的发酵乳样品的黏度无显著变化，可能是发酵前期，菌种的生长速率较慢，导致发酵前期发酵乳的黏度没有变化；在3～12 h 过程中，发酵剂组和复配组发酵乳样品的黏度迅速上升，且XN1904E 组发酵乳样品的黏度仍维持不变，此发酵阶段（3～12 h）植物乳杆菌XN1904E 单独发酵组r仍未出现凝乳现象，说明在发酵前期植物乳杆菌XN1904E单独发酵的凝乳效果较差。而在12～24 h 过程中，XN1904E 组发酵乳样品的黏度呈显著上升趋势（P＜0.05），又复配组发酵乳样品的黏度比发酵剂组高13.6%，复配组黏度最大高达18320.000 mPa·s。可能是因为植物乳杆菌XN1904E 后期迅速繁殖，其产生胞外多糖增加发酵乳的黏度[17]。

图3 发酵乳发酵过程中黏度的变化

2.2 植物乳杆菌（XN1904E）发酵乳多糖含量的结果

各发酵乳的多糖含量测定结果见图4。由图4 可知，发酵剂组、XN1904E组和复配组三组发酵前脱脂乳中多糖含量分别为378.542 μg/mL、626.167 μg/mL、370.127 μg/mL。在发酵完成后，发酵剂组发酵乳样品中的多糖含量下降了90.873 μg/mL，XN1904E 组和复配组发酵乳中多糖含量分别上升了180.617 μg/mL、46.288 μg/mL。加入菌株XN1904E 后，发酵乳中的多糖含量明显增加，此结果与添加菌株XN1904E 后黏度显著上升相结合，说明植物乳杆菌XN1904E 迅速繁殖，产生大量的胞外多糖可以改善发酵乳的黏度和组织结构，减少乳清析出[18]。

图4 植物乳杆菌（XN1904E）对发酵乳产糖含量的影响

2.3 植物乳杆菌（XN1904E）发酵乳风味成分的结果

各发酵牛乳组的挥发性成分测定结果见表1。由表1的结果可知，发酵乳的风味成分种类繁多。复配组发酵乳共有挥发性成分35种，其中醛类9种，酮类6种，烷烃类6种只来5种，醇类6种，其他3种。发酵剂组发酵乳共测得挥发性成分29种，其中醛类8种，酮类4种，烷烃类6 种，酯类4 种，醇类4 种，其他3 种。XN1904E组发酵乳测得挥发性成分30种，其中醛类10种，酮类3种，烷烃类6种，酯类3种，醇类4种，其他4种。

（1）醛类化合物。醛类化合物在酸奶发酵过程中属于过渡态化合物，会被迅速还原生成伯醇或被氧化生成相应的酸[19]。从表1 中可以看出，发酵前，发酵剂组和复配组的醛类物质基本相同，主要物质有壬醛、癸醛、2-甲基烯醛、正十五碳醛、十六醛、2,4-二甲基苯甲醛，XN1904E 组只有壬醛、癸醛、庚醛三种醛类物质。壬醛主要来自于不饱和脂肪酸，是由中间态的过氧化物产生的，具有玫瑰、柑橘等香气[20]。发酵24 h后，三组醛类风味物质种类明显增加，尤其是XN1904E 组醛类物质增加到10 种，且壬醛、癸醛、十六醛、2,4-二甲基苯甲醛相对含量分别13.259%、13.684%、21.952%、2.474%。与发酵前脱脂乳相比，更加丰富了发酵乳的香味。

（2）酮类化合物。酮类酮类化合物风味独特，阈值低，乳制品中最重要的挥发性物质是甲基酮类物质，它们会赋予发酵乳奶水果、花香等香气风味物质[21]。发酵前，发酵剂组和复配组酮类物质基本相似，且XN1904E 组酮类物质只有2,3-庚烷二酮，且相对含量只有0.322%。发酵后，发酵剂组的酮类物质种类无变化，而复配组和XN1904E 组的酮类物质明显增多。这可能是植物乳杆菌XN1904E 发酵后代谢产生[22]。

（3）酯类化合物。酯类化合物是一种很重要的风味物质，脂肪是酸奶酯类的主要来源，主要是通过脂肪酸水解和微生物代谢产生, 尤其是中短链脂肪酸水解产生的甲基酮和内酯对酸奶风味产生影响[23]。发酵前，发酵剂组、复配组和XN1904E 组都只检测出一种酯类为邻苯二甲酸二丁酯。发酵后，复配组的酯类物质增加到5 种，分别为苯乙醇乙酸酯、邻苯二甲酸酯、顺式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯、二十六烷酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯。发酵剂组的酯类物质增加到4 种，XN1904E 组也有三种，这可能是微生物代谢产生。

（4）醇类化合物。醇类化合物是乳品中比较普遍存在的风味物质，它主要是由脂肪酸氧化酶作用于多不饱和脂肪酸衍生而来的[24]。醇类物质虽然对风味贡献不大，但是醇类可以转化胃酸。发酵前，脱脂乳中都没有醇类化合物。发酵后，三组醇类化合物都有所增加，丰富的醇类物质使发酵酸奶能表现出典型的醇香味。

表1 不同样品中挥发性成分

（续表1）

3 结 论

对发酵剂组、复合组和XN1904E 组的pH、滴定酸、黏度、多糖含量和风味成分进行测定，发酵乳的pH 和滴定酸的结果基本一致，发酵剂组、复合组在发酵9 h 后，pH 分别为4.275、4.316；发酵剂组、复合组在发酵9 h 后，滴定酸分别为77.731oT、79.085oT，但XN1904E 组的pH 和滴定酸都未能达到发酵乳的要求[16]，说明植物乳杆菌XN1904E在发酵前期产酸能力不强；又复配组发酵乳样品的黏度明显高于发酵剂组和XN1904E 组，复配组黏度最大高达18320.000 mPa·s。发酵剂组发酵乳样品中的多糖含量下降了90.873 μg/mL，XN1904E 组和复配组发酵乳中多糖含量分别上升了180.617 μg/mL、46.288 μg/mL，说明植物乳杆菌XN1904E 产生的胞外多糖对发酵乳的黏度有很大的影响。与发酵前脱脂乳相比，复合组风味物质的种类增加至35 种，分别比发酵剂组和XN1904E 组多6 种和4种，醛类物质的相对含量减少了15.793%，而酮类、烃类、酯类和醇类风味物质的相对含量都有所增加，更加丰富了发酵乳的香味。