马 英，鲁 亮，龚正达，李华昌，杨贵荣，刘起勇

哺乳动物是动物类群中分类学和物种多样性研究非常深入的类群[1]，近20年来分子系统学的研究依然揭示着该类群中存在大量被形态学研究忽视的种类[2]。小型兽类一般指兔形目的鼠兔属、啮齿目、劳亚食虫目和翼手目等小型哺乳动物，其中翼手目以外的类群统称为非飞行小型兽类(Nonvolant small mammals)。非飞行小型兽类在各种生态系统中发挥着重要的功能，如参与植物种子扩散、草场土壤更新等重要的生态环节[3-4]。在食物链中，小型兽类作为初级消费者，为上层的捕食动物提供了大量的食物，是食物链的重要组成部分[5]。因此，小型兽类的生物多样性具有重要的生态学意义。同时，小型兽类在许多人兽共患病的保存和传播过程中都具有重要意义，从而会影响生态系统中人群的健康[6]。相关研究表明，小型兽类传播病原体与当地小型兽类的生物多样性水平相关[7-10]。

目前，我国记录的非飞行小型兽类的数量有350种[11]。通常在宿主动物多样性和动物流行病学的调查取样中，小型兽类种类的准确鉴定主要依赖专业的形态分类学专家。但现在大量的动物流行病学调查中往往没有分类专家的实时参与，鉴定的准确性容易出现问题。而且，越来越多的研究发现形态学确定的小型兽类种类中存在很多形态差异很小的隐存种[12-13]，这增加了鉴定的难度。DNA条形码(DNA barcoding)技术是本世纪初发展起来的一项利用DNA序列进行物种鉴定的技术[14]。通过十多年的数据积累和各类群的研究，该技术被证明在鉴别许多动物类群中是可行的，包括各类群小型兽类中也是如此[15-20]。因此，我们可以利用DNA条形码技术协助开展系统的小型兽类生物多样性研究。

云南南部从上世纪80年代开始出现大范围的家鼠鼠疫疫情，涉及到临沧市的部分县区[21]。为了掌握当地鼠疫宿主动物的构成，尤其是自然环境中各种非飞行小型兽类种类的构成，以便在鼠疫动物流行病学调查中能够有明确的宿主动物分类学数据，能更好地分析各种野生鼠类在鼠疫动物间流行过程中的作用，我们开展了临沧大雪山自然保护区及周边地区中非飞行小型兽类的多样性调查。为了能够更好阐明当地非飞行小型兽类物种多样性特征，我们在应用传统形态学分类的基础上，利用DNA条形码技术对所获标本进行了进一步鉴定。

1 材料与方法

1.1研究区域概况 临沧大雪山自然保护区位于临沧市临翔区和云县交界处，东靠澜沧江，地理坐标：东经99°40′34″～100°22′01″，北纬23°17′52′～24°57′28″之间。南坡位于临翔区境内，北坡为云县地域。最高峰海拔3 429 m，因冬季有积雪，被当地称为大雪山。整个保护区处于横断山区怒山山脉南段的高山纵谷地带，最高峰与澜沧江的相对高程2 600 m左右，形成了丰富的自然景观，植被的垂直分布非常明显。1 800～2 000 m范围内为季风常绿阔叶林带、2 000～2 600 m之间为中山湿性常绿阔叶林带、2 600～3 000 m之间为针阔叶混交林带、3 000～3 400 m之间为苍山冷杉林带和亚高山灌丛草甸带[22]。

1.2 方 法

1.2.1调查时间和范围 调查工作从2008年11月22日开始，至12月6日结束。在海拔1 200～3 200 m之间按照每200 m海拔进行一次调查的原则进行了14个点的调查。每天布放360个左右的鼠夹，第2 d上午检查捕获情况。调查点及其经纬度和海拔高度见表1。

表1 采集点经纬度和海拔以及布夹和捕获情况Tab.1 Location and altitude of trap sites, trap number and number of captures for each locations

1.2.2非飞行小型兽类种类鉴定 现场捕获的非飞行小型兽类标本首先根据外部形态特征进行初步的分类。然后选择皮张和头骨没有破损、发育成熟及形态有代表性的个体制作成假剥制标本，再根据头骨形态和牙齿形态进行较为准确的鉴定。啮齿目标本形态鉴定的依据是《中国啮齿类》[23]，其他小型兽类的形态鉴定参考《中国兽类野外手册》[24]。

1.2.3 DNA条形码鉴定

1.2.3.1组织样品的保存 现场采集标本取肌肉组织用95%酒精浸泡保存，带回实验室后低温冷冻保存。提取肌肉组织的总DNA时，使用QIAGEN DNeasy Kit(凯杰生物技术有限公司，上海)，根据试剂盒的使用方法提取DNA，并冷冻保存备用。

1.2.3.2线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因片段的PCR扩增 在25 mL反应体系中，10×Buffer 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，DNA模板1 μL，LATaqDNA聚合酶(宝生物工程有限公司，大连) 0.75 U。扩增条件为：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 1 min，共35个循环。其中引物首先采用BatL5310和R6036R[25]，在不能扩增的情况下，选择鸡尾酒引物VF1LFt1和VR1LRt1[26]进行扩增。扩增产物直接送测序公司进行双向测序。

1.2.3.3DNA条形码的序列分析 首先用Chromos软件观察测序峰图质量，如果峰图质量很差不能准确判断碱基，则重新进行扩增和测序。拼接后的测序结果用Clustal X[27]软件进行多重序列比对，并进行适当的手工调整。同时将测定的序列在NCBI上运行BLAST程序进行序列同源性比较，以确保所获得的序列是目标序列，排除扩增得到假基因序列的可能。根据BLAST结果，将相似度大于98%的序列作为参考序列用于系统树构建及小型兽类的鉴定。对于GenBank中没有近缘序列的个体，首先依据形态特征定种；对于难以用形态特征确定种类的食虫类小型兽类，将头骨照片和序列提交给中国科学院昆明动物所的何锴博士进行鉴定。所有小型兽类中文名和学名参照“中国哺乳动物多样性编目(第2版)”[11]。最后运用Mega6[28]软件基于Kimura-2-parameter (K2P)[29]模型计算各物种的遗传距离。采用邻接法构建全部COI基因序列的NJ系统树，对NJ树进行内部分支检验与1 000次Bootstrap检验分析，来确定各支系的BS置信度。

1.2.3.4利用DNA条形码进行样品鉴定 使用DNA条形码进行标本鉴定遵从2个原则, 一是序列是否与已知物种的序列构成单系[30]，二是遗传差异在一定的范围之内。真兽亚纲哺乳动物COI基因的条形码区域种间平均遗传距离约为7.39%(K2P距离)[31]，因此对于用于DNA条形码的COI基因，本研究选用8%作为界定不同物种的标准。

当测得序列与参考序列构成单系，且单系的BS值大于等于0.95时认为二者为同一物种，当测得序列与参考序列不构成单系时，则认为并非同一物种。若遗传距离中等(85%～92%)，或测得序列与GenBank中几个不同物种序列相似度相同时，认为该标本的分子鉴定只能精确到属，但不能确定到种。

2 结 果

2.1小型兽类捕获情况 在各种生境中，共捕获各种非飞行小型兽类177只。其中，通过形态学鉴定确定其中131只属于啮齿目、劳亚食虫目的17个物种，无法明确到种的有啮齿目白腹鼠属和劳亚食虫目个体计46只(见表2)。制作的凭证标本中，白腹鼠属的标本暂时保存在中科院动物所标本馆，其他标本保存在临沧市疾病预防控制中心。

2.2测序结果和系统树的构建 由于中国鼩猬捕获数量较多，所以只扩增了其中4个样品的COI基因。通过两套引物的扩增，从152份样品中共成功扩增并测序了121份样品(表2)，扩增和测序成功率为79.6%。扩增片段的有效长度在650 bp左右，没有发现片段的插入或缺失，证明扩增的片段确实为线粒体基因组的COI基因片段。所得序列都提交GenBank共享，各种对应的注册号见表2。通过构建系统树，发现这些序列形成了25个有效的分支，多个个体构成的分支都有100%的BS支持度(图1)。其中，啮齿目的鼠类共17种，分属鼠科、田鼠科和松鼠科；劳亚食虫目中的猬科2种，鼩鼱科6种。

根据系统树的分支，可以发现临沧大雪山地区白腹鼠属的种类应该有6种，而不是根据形态特征鉴定的2～3种，说明白腹鼠属中存在形态学的隐存种。此外，劳亚食虫目的大量标本无法用形态特征予以准确鉴别，通过系统树可以确定存在6个种。

3 讨 论

3.1鼠科的隐存种问题 啮齿目鼠科是分类学研究比较深入的一个小型兽类类群，但即使这样，还有许多种类的分类地位存在争议，鉴定特征不明确，同时一些类群中存在隐种。在临沧大雪山地区的啮齿动物中，白腹鼠属的分类问题显得尤其突出。在白腹鼠属的传统形态分类中，被毛中是否有刺毛是分类的重要特征[23,32]。但在临沧大雪山高海拔生境中捕获的白腹鼠标本往往都没有刺毛，因此，区分安氏白腹鼠和北社鼠有一定的难度。同时由于地处中国和东南亚交界处，原本记录在东南亚的白腹鼠(N.niviventer)在该地区也有分布[13,33]，因此更增加了形态分类的难度。

表2 捕获标本的形态分类、分子鉴定结果和数量及相关信息Tab.2 Information of morphologic classification, identification with DNA barcoding, number and other related data

括号中为作为参考序列的GenBank注册号，每个物种分支节点的自举检验(BS)值标注在节点上方。图1 基于COI 基因片段的临沧大雪山小型兽类Neighbor-Joining系统树Fig. The Neighbor-Joining phylogenetic tree of small mammals of Lincang mountain based on data of COI gene fragment.

在我国现有白腹鼠属描述的种类中，被毛颜色鲜艳呈棕红色调，背部硬刺毛发达的种类只有针毛鼠一种[23,34]，但通过DNA条形码技术和分子系统学研究，发现具备上述特征的白腹鼠属的种类不少于3种[13]。在临沧大雪山的生态环境中，这3种都存在，只是在海拔分布上存在一定的差异。这种现象说明，白腹鼠属中存在明显的隐存种现象，该属的物种多样性被远远低估了。

3.2不同生境中小型兽类的物种多样性变化 临沧大雪山不同海拔的植被类型大体可以分为季风常绿阔叶林带(1 800～2 000 m)、中山湿性常绿阔叶林带(2 000～2 600 m)、针阔叶混交林带(2 600～3 000 m)、苍山冷杉林带(3 000～3 400 m)和亚高山灌丛草甸带，其中2 600 m以下为北亚热带，2 600 m以上为南温带[22]。在2 000 m以下地势较缓的区域，往往是农耕区；2 000～2 400 m为退耕还林区域，多为经济林；2 400 m以上则成为保护区管辖区域，人类活动和干扰较少。

在临沧大雪山3 000 m以上的冷杉林带和亚高山灌丛中，捕获率为2.45%，主要为澜沧江姬鼠、昭通绒鼠、安氏白腹鼠和大长尾鼩等4种。在2 600～3 000 m之间的针阔叶混交林生境中，捕获率为4.63%，小型兽类种类按捕获数量排序有中国鼩猬、澜沧江姬鼠、北社鼠、安氏白腹鼠、侧纹岩松鼠、珀氏长吻松鼠和多种鼩鼱类等13种，包括笔尾树鼠和攀鼠等稀有种类。在2 000～2 600 m的常绿阔叶林生境中，捕获率为2.64%，包括中国鼩猬、北社鼠、针毛鼠、白腹鼠未定种、大绒鼠、黑缘齿鼠、澜沧江姬鼠和鼩鼱类等11种。在2 000 m以下的生境中，农田较多，捕获率达到5.25%，捕获小型兽类包括黑缘齿鼠、黄胸鼠、灰麝鼩、毛猬、短尾鼩、大绒鼠、白腹鼠未定种和拟刺毛鼠等11种，其中与人类活动关系密切的小型兽类有两种大鼠属种类。可以看出，海拔2 000～3 000 m的生境中，小型兽类的物种多样性是最高的。该结果与其他山地多样性调查的结果一致，说明在山地环境中，中海拔生境是物种多样性最为丰富的生境。

3.3不同小型兽类种类的海拔分布 根据不同小型兽类种类的采集记录，可以发现这些小型兽类在临沧大雪山的海拔分布范围基本与其在我国的纬度分布基本是对应的。以白腹鼠属的种类为例[13]，安氏白腹鼠(N.andersoni)分布在我国青藏高原东缘一直到秦岭的高海拔地区，相应的，在临沧大雪山该种也分布在较高海拔(2 500～3 200 m)。北社鼠(N.confucianus)在青藏高原东南缘沿大巴山、秦岭、太行山一直分布到华北地区[16]，在临沧大雪山则分布在安氏白腹鼠分布范围的下缘。针毛鼠(N.fulvescens)基本分布于我国华南、西南南部地区，而在临沧大雪山则分布在2 300～2 500 m之间的生境中，白腹鼠(N.niviventer)的分布一般认为在东南亚地区，在临沧大雪山则分布于较低海拔的生境中(1 700～2 650 m)。临沧大雪山捕获的鼩鼱科种类也都是东洋界物种[35]。这些种类在大雪山的分布基本也在2 650 m海拔以下地区，和白腹鼠属东洋界种类的海拔分布有相似之处。

(致谢：感谢临沧市疾病预防控制中心的其他工作人员在现场调查中的工作，感谢临沧大雪山自然保护区的两位护林员在现场调查中予以的热心帮助。感谢中国科学院昆明动物所的何锴博士在食虫类小型兽类的分子鉴定给予的帮助。)

利益冲突：无

本文引用格式：马英，鲁亮，龚正达，等.云南临沧大雪山自然保护区非飞行小型兽类物种多样性调查[J].中国人兽共患病学报，2020,36(7)：572-577，582. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.051