严绍裕，傅成杰，余燕华，钱叶会

（福建林业职业技术学院，福建 南平 353000）

森林土壤微生物主要包括土壤细菌和土壤真菌，而真菌作为真核生物的群体之一，分担着分解枯落物的角色、扮演着“微生物-土壤-植被”相互作用中的传递者[1]。森林土壤真菌是森林生态环境的重要成员，一方面积极参与森林土壤的物质分解、养分转化及能量交换等，为植物发育提供营养物质；另一方面，有毒真菌群落通过土壤侵入植物，对植物的生长产生危害[2-3]。森林生态环境受土壤真菌数量与土壤真菌群落结构多样性的影响，土壤真菌的数量不但直接影响森林土壤的化学活性及森林土壤养分的构成与转变，而且也是森林土壤活力的具体体现，是林地生产力保持与修复的主要动力之一[4]，对林业的发展与生产起着关键的作用。森林环境的养分、植物种类组成与土壤真菌群落结构与多样性互相影响，研究土壤真菌的数量与土壤真菌结构的多样性是属于从上层揭示森林生态环境的能量流动与物质循环[5]。但是森林生态环境的复杂性间接导致土壤真菌数量的丰富性、土壤真菌群落的复杂性、直接观察土壤真菌的困难性[6]。最原始的研究方法是通过配制不同的真菌培养液对土壤真菌的单纯培养，再依据培养真菌的形态差异进行分类与鉴别，最后得到土壤样品中真菌的数量与土壤真菌群落结构的信息[7]。研究者对土壤真菌的研究逐渐深化，需要更深入获得更深层次的信息，因而对研究土壤微生物技术有了更高的要求，引起了高通量测序技术的快速发展，这就为分析真菌的数量与种类、真菌群落结构的多样性提供更加全面准确的方法[8]。本研究旨在揭示不同代数杉木林土壤中真菌的数量与真菌群落结构的多样性，为杉木人工林连栽地的土壤修复提供理论基础。

杉木[Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.]是我国南方最重要的用材树种之一[9]。长期以来的研究表明，杉木人工林传统种植方式如炼山、整地、纯林种植以及连栽等会导致林分养分流失大而归还速度比较慢、林分生物多样性下降、有毒物质积累等，从而影响了杉木人工林林地的可持续经营[10-12]。杉木人工林土壤活力的降低改变了土壤的物理与化学性质、土壤的真菌数量、真菌群落多样性。以往有关杉木连栽的研究主要集中在连栽对杉木人工林生长及生理活性变化、土壤理化性质的改变等，而关于不同连栽代数杉木林的土壤真菌数量与真菌群落多样性的研究报道较少。鉴于此，本论文以杉木一代林（FCF）、连栽二代林（SCF）及连栽三代林（TCF）为研究对象，采用高通量测序技术，分析不同连栽代数杉木人工林土壤真菌的数量与种类、真菌群落多样性，并进一步分析真菌群落多样性及其和环境因素的相关关系，从理论上探明杉木连栽对土壤真菌群落结构多样性的影响，为杉木人工林高效培育奠定理论参考依据。

1 试验地概况

试验样地设于福建省南平王台镇溪后村，平均海拔200 m，年平均气温19.3℃，年平均降雨量1 969 mm，属于亚热带季风气候，土壤为红壤，土层深度100 cm以上，具体林分情况见表1。杉木一代林（FCF）林下灌木层主要有杜茎山 （Maesa japonica）、寒刺泡（Rubus buergeri）、粗叶榕（Ficus hirta），草本层以观音莲座蕨（Angiopteris fokiensis Hieron）、水龙骨（Rhizoma polypodiodis）、金毛狗（Cibotium barometz）为主。连栽二代林（SCF）与FCF的水平相距为500 m，林下灌木层以绒毛山胡椒（Lindera nacusua）、寒刺泡为主，草本层以腺毛金星蕨 （Thelypteris glanduligera）、毛柄短肠蕨（Athyrium iseanum）、金毛狗为主。连栽三代林（TCF）与FCF的水平相距为1.3 km，林下灌木层以绒毛山胡椒、粗叶榕为主，草本层以铁芒萁（Dicranopteris linearis）、金狗脊为主。

表1 林分基本特征Tab.1 Characteristic of sample area

2 材料与方法

2.1 土壤采集

2018年7月底在不同连栽代数林分中分别设置3块20 m×20 m样地进行林分调查。每个样地采用“梅花”形取样法[13]分5个点分别采集0～10 cm土层土壤，取样后将每块样地的土壤样品混匀后，用四分法保留500 g左右，去除动植物物残体和石子后过2 mm筛，用无菌塑封袋装土壤样品立即放于4℃冰盒保存带回实验室。取回的土壤样品分成常温保存、-80℃低温保存[14]。

2.2 土壤样品的测定方法

采用光谱分析法测定土壤的含水率[15]；参照国标测定土壤的物理性质、pH值、全磷、全钾[16]；土壤全碳和全氮含量采用近红外光谱分析法测定[17]。

2.3 数据处理

2.3.1 物种分类与丰度分析

OTU即分类操作单元，为了进行方便研究，设定一个分类的单元。利用QIIME软件[18]中的UCLUST[19]对Tags进行聚类分析、获得分类操作单元，对分类操作单元进行分类学的注释是基于Silva分类学数据库，即可得到各分类学水平下物种的组成及相对丰度。

2.3.2 Alpha多样性统计分析

对土样的Alpha多样性指数的评估使用Mothur软件进行分析。为比较样品间的Alpha多样性指数，在97%相似度水平下，分析时先进行样品间的序列数进行标准化。计算群落Chao1指数[20]、Ace指数[21]、Shannon指数[22]、Simpson指数[23]。

2.3.3 统计分析

利用Excel 2010计算实验数据的平均值和标准偏差。Pearson相关性分析使用SPSS 20.0软件[24]，利用CANOCO 5软件完成不同代数杉木林土壤真菌种类与环境因子影响的分析[25]。

3 结果与分析

3.1 不同连栽代数杉木人工林土壤真菌种类分析

通过高通量测序得到不同连栽代数杉木人工林土壤主要真菌门类包括子囊菌门、担子菌门、接合菌门、Rozellomycota门等（图1），真菌群落结构的相对丰度的分布在不同代数杉木林的土壤中存在差异。子囊菌门为FCF、SCF、TCF的真菌优势菌门，不同代数杉木林土壤中子囊菌门相对丰度的高低顺序为SCF＞FCF＞TCF，其中SCF与TCF之间相对丰度具有显著差异，SCF和FCF之间不具有显著差异；不同代数杉木林土壤中担子菌门相对丰度的高低顺序为FCF＞SCF＞TCF，表明随着连载代数的增加，担子菌门在杉木林土壤中的相对丰度逐渐降低；不同代数杉木林土壤中接合菌门相对丰度为，FCF的相对丰度最高，其次为TCF，SCF的相对丰度最低，FCF与TCF之间接合菌门相对丰度差异不显著，而SCF接合菌门相对丰度则显著高于FCF、TCF。

图1 不同连栽代数杉木人工林土壤真菌群落结构相对丰度Fig.1 Relative abundant of soil fungi community structure in different planting generations of Chinese fir plantation

3.2 不同连栽代数杉木林土壤真菌群落结构多样性分析

通过对不同代数杉木林真菌群落多样性指数分析(如图2)，不同代数杉木林中群落多样性指数Ace为FCF最高，其次为SCF，最低为TCF，并且FCF和SCF多样性指数Ace显著高于TCF；不同代数杉木林中群落指数Chao1由小到大为TCF＜FCF＜SCF，且三种林分之间均具有显著差异；不同代数杉木林中群落多样性指数Simpson由大到小的顺序为TCF＞FCF＞SCF，且三种林分之间均具有显著差异；不同代数杉木林中群落多样性指数Shannon的大小顺序为FCF＞SCF＞TCF，并且FCF和SCF Shannon指数显著高于TCF。土壤真菌群落的物种丰度、物种均匀度会影响Shannon指数、Simpson指数，若物种丰度相同，群落中均匀度大的物种，则认为该群落的多样性越丰富。Ace指数、Chao1指数、Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明土样的物种多样性越大[26]。不同林分中FCF的群落Ace指数、Chao1指数、Shannon指数均为最大，而Simpson指数最小，说明FCF真菌数量丰富；不同代数杉木人工林中TCF的群落Ace指数、Chao1指数、Shannon指数均为最小，而Simpson指数最大，说明TCF真菌数量在减少。不同代数杉木林中真菌群落多样性大小顺序为FCF＞SCF＞TCF，即一代杉木林中的群落多样性最高，由此可得随着杉木林连植代数的增加群落多样性逐渐降低。不同代数杉木林中OUT的大小顺序为FCF＞SCF＞TCF，而FCF与SCF之间没有明显的差异；不同代数杉木林中从Coverage看，FCF的覆盖度最高，并且不同林分的Coverage值在0.85以上，能够反映出土壤中真菌群落比较丰富。

图2 不同连栽代数杉木人工林土壤真菌群落多样性指数Fig 2 Soil fungi community diversity index in different planting generations of Chinese fir plantation

3.3 不同代数杉木林土壤真菌类群与环境因子的关系分析

森林拥有一个复杂的生态环境，而森林环境中的植物群落、气候条件等都对土壤真菌的群落活动产生影响[27]，反之土壤真菌的群落活动也会对森林土壤的理化性质产生影响。

由图（3A）得到土壤容重、土壤含水率等对优势真菌的数量有较大影响。其中，土壤容重与子囊菌门、担子菌门、接合菌门存在负相关关系；土壤含水率与担子菌门、接合菌门呈现正相关的影响，与子囊菌门呈现负相关的影响。由此说明不同代数杉木林的土壤真菌群落与其土壤物理性质存在一定相互作用。

由图（3B）得到全磷、全碳、pH对真菌群落分布存在一定的影响。全磷与子囊菌门、担子菌门、接合菌门呈现负相关的影响；土壤pH影响土壤化学性质等控制真菌的生物数量，而使土壤群落组成、多样性受到干扰。全碳、pH与子囊菌门、担子菌门、接合菌门存在正相关的关系；由此说明不同代数杉木林的土壤真菌群落与其土壤化学性质存在一定的相互影响关系。

图3 不同连栽代数杉木人工林土壤真菌门类与土壤物理化学性质RDA排序图Fig.3 The ordination diagram of RDA about soil fungi phylum and dominant order with environmental factors in different planting generations of Chinese fir plantation

4 结论

森林土壤中微生物主要包含了土壤真菌与细菌，在生态环境中起着关键的作用，并与其他成员共同推动着陆地生态系统中的能量流动、信息交换、物质循环[28]。森林真菌群落的生物多样性与森林生态环境的结构与组成息息相关，是保持土壤活力的关键部分[29]。本研究通过运用高通量测序法研究了不同代数杉木林的土壤真菌的种类与数量以及结构多样性，结果表明不同代数杉木林土壤的主要真菌优势门类包括子囊菌门、担子菌门、接合菌门。不同代数杉木林土壤中子囊菌门相对丰度的高低顺序为SCF＞FCF＞TCF；不同代数杉木林土壤中担子菌门相对丰度的高低顺序为FCF＞SCF＞TCF；不同代数杉木林土壤中接合菌门的相对丰度为FCF的相对丰度最高，其次为TCF，SCF的相对丰度最低。表明随着连植代数的增加，真菌优势门类的总体趋势表现为在杉木林土壤中的相对丰度逐渐降低。

采用多个指标评价不同代数杉木林土壤真菌数量与群落结构的多样性，结果表明不同代数杉木林中真菌群落多样性丰富度大小顺序为FCF＞SCF＞TCF，即一代杉木林的群落多样性丰富度最高，由此可得随着杉木林连植代数的增加群落多样性丰富度逐渐降低。不同代数杉木林中OUT的大小顺序为FCF＞SCF＞TCF；不同代数杉木林中从Coverage看，FCF的覆盖度最高，并且不同林分的Coverage值在0.85以上，能够反映出土壤中真菌群落比较丰富。由此说明了连植导致了杉木林土壤真菌群落结构与多样性发生了变化。

森林拥有一个复杂的生态环境，生活在这个复杂环境中的真菌群落受森林环境中的气候、温度、各种养分变化的影响；而真菌群落结构的多样性也会影响森林环境的养分结构、植物种类等。从物理性质与真菌优势门类的RDA分析得到土壤容重与子囊菌门、担子菌门、接合菌门存在负相关关系；土壤含水率与担子菌门、接合菌门呈现正相关的影响，与子囊菌门呈现负相关的影响。由此说明不同代数杉木林的土壤真菌群落与其土壤物理性质存在相互作用的关系。从化学性质与真菌优势门类的RDA分析得到全磷与子囊菌门、担子菌门、接合菌门呈现负相关的影响；土壤pH影响土壤化学性质等控制真菌的生物数量，而使土壤群落组成、多样性受到干扰。全碳、pH值与子囊菌门、担子菌门、接合菌门存在正相关的关系；由此说明不同代数杉木林的土壤真菌群落与其土壤化学性质存在一定的相互影响关系。不同代数杉木林的土壤真菌群落的多样性受到土壤物理化学性质不同程度的影响，可能是由于森林环境的发生了变化，而土壤真菌群落对于这样的变化特别敏感，由此出现真菌群落聚集与单一化的现象。

随着杉木林的连栽代数的变化，不同代数杉木林中土壤真菌群落在空间上呈现不同变化规律，并且随着杉木林的连栽，真菌群落多样性出现一定的差异变化。森林环境中的植被类型决定了土壤真菌的群落结构，土壤真菌的群落结构又影响着森林环境，由此出现真菌群落与森林环境相互作用的结果。在这个复杂的森林环境中“微生物-土壤-植被”又存在着复杂相关关系[30]。