马春峰，郭振东，周靓

(1. 吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062；2. 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，吉林 长春 130122；3. 吉林大学动物医学学院，吉林 长春 130062)

布鲁菌是一种重要的人兽共患病病原体。它是一种需氧不运动、无荚膜的革兰阴性球杆菌，细胞内寄生，可以引起包括牛、猪、羊和犬等多种动物流产[1]。有4种类型的布鲁菌可以感染人并引起人类疾病，包括羊种布鲁菌(B.melitensis)，牛种布鲁菌(B.abortus)，猪种布鲁菌(B.suis)和犬种布鲁菌(B.canis)。其中以羊种布鲁菌对人体的感染性最强，致病率最高，危害最为严重。布鲁菌的毒力因子是细胞壁脂多糖，具有光滑型脂多糖的布鲁菌毒力更强。布鲁菌病主要损害人、畜的生殖系统和关节，对畜牧业的发展以及人类健康产生较大的危害[2]。布鲁菌病通常是一种职业病，主要感染经常接触受感染动物或受污染动物组织的人群，如农民、临床兽医师和屠宰工人等，消费者通过食用未经高温消毒的奶制品也有零星感染的案例[3]。另外一个高风险感染群体就是实验人员，实验人员常常因实验过程中产生的生物气溶胶而暴露感染[4]。本文综述了布鲁菌基本生物学特征、经空气感染的能力及感染后临床表现，分析了实验室感染案例的主要原因，并提出了相应的管理措施，以期为布鲁菌实验室安全管理提供理论依据和借鉴参考。

1 布鲁菌与生物恐怖主义

布鲁菌是生物安全三级病原体，也是一种潜在的生物恐怖剂。其极易感染人，半数感染剂量小，感染途径多，例如通过呼吸道黏膜、眼结膜、肠道或破损的皮肤均可感染，也有极少的案例通过器官移植、性接触、母乳喂养或经胎盘感染。布鲁菌感染人后可引起持续的疾病和后遗症，很难从体内清除，被美国疾病预防控制中心列为B类病原体[5]。高温和大多数消毒剂均可以杀灭布鲁菌，但在特殊环境下布鲁菌甚至可以存活2年，对人和动物构成持续威胁。1954年，布鲁菌成为美军武器化的第一个病原体，随后包括英国在内的多个国家也将布鲁菌武器化。布鲁菌恐怖剂属于失能剂，感染后潜伏期长、致死率低，但发病率高，给感染者带来持续的病痛。随着医疗技术的发展，布鲁菌病可以治愈，且随着新的更强有力的生物恐怖剂的不断出现，虽然目前布鲁菌仍在世界卫生组织WHO的生物恐怖剂清单中，但已经几乎不被考虑了。

2 布鲁菌感染临床病理表现

布鲁菌侵入机体后，首先迅速被多形核和单核巨噬细胞吞噬，但其能通过抑制吞噬体-溶酶体融合而躲避巨噬细胞杀伤效应，并在巨噬细胞中复制。布鲁菌的潜伏期非常不固定，短则1～3 d，长则60 d甚至数月，平均1～2个月。潜伏期后，机体出现类似于流感病毒的非特异性症状。发热是最典型，也是最普遍的症状(90%～95%)，持续性发热、间歇性发热或不规律发热均有可能。同时，可能伴有虚弱、盗汗(40%～90%)、寒栗、全身或局部关节痛(20%～40%)、萎靡(80%～95%)、体重减轻或全身疼痛(40%～70%)等。

在疾病早期，患者常常出现菌血症，在血液样品中可以分离检测到布鲁菌。布鲁菌随着血液循环定殖于全身多个组织器官，特别是网状内皮组织，如肝、脾和骨髓造血系统等，进而引起一系列局部疾病。人感染后的临床表现多种多样，70%的患者出现神经系统症状(如头痛、沮丧和易怒等)和肠道系统症状(如厌食、恶心、呕吐、腹痛、腹泻或便秘)。羊种布鲁菌感染的病例偶尔还会出现回肠炎、结肠炎或腹膜炎。大多数病例还会出现肝功酶升高，偶见肝脓肿和急性胆囊炎。15%～25%的病例出现咳嗽、胸痛等症状，但胸部X射线片无法发现异常，偶见肺脓肿、结节和胸膜渗出。10%～20%的病例出现淋巴结病变，20%～70%的病例出现脾肿大，10%～30%出现肝肿大。皮肤的临床表现可能包含溃疡、瘀点、紫癜和结节性红斑。布鲁菌病的骨关节并发症也很常见(40%)，包括关节炎、黏液囊炎、骨髓炎或脊椎炎等。其他并发症如附睾炎、脑膜炎、脑炎、癫痫和神经病等则很少出现(<2%)。心血管并发症包括心肌炎、心包炎和动脉瘤。血液异常包括贫血、嗜中性白血球减少和血小板减少[6]。在很多临床样本中均可以分离到布鲁菌，如脓液、血液、骨髓、关节滑液和组织等，极少情况下也可以在脑脊液、尿液、生殖分泌液中分离到细菌。布鲁菌感染者即使不加治疗，致死率也是极低的(<2%)。几乎所有患者均可采用抗生素治疗法，治愈复发率小于10%。

3 布鲁菌经空气感染与传播能力

布鲁菌极易气溶胶化，很多未知源头的实验室感染案例均指向气溶胶[7-10]。曾有一家拥有129名员工的大型屠宰场暴发布鲁菌病，在其环境空气样本中便可分离到布鲁菌[11]。气溶胶化后危害极大，无色无味，感染于无形之中，载有病原体的气溶胶微粒可随风播散至远处，短时间内造成大面积感染[8,10]。呼吸道是布鲁菌感染的一种重要途径，研究表明，人体通过气溶胶途径吸入10-100个细菌便足以构成感染[12]。有学者采用豚鼠模型证实布鲁菌经气溶胶途径比经消化道途径更加易感[13-14]。但气溶胶途径感染后，患者的临床表现与经其他途径感染并无显著差异[12]。

布鲁菌在人与人之间的传播很少发生，仅有极个别案例发生在血液暴露、感染组织暴露和性接触的情况下[12]。付莹莹[15]开展了BALB/c小鼠间的直接接触传播试验，将24只感染的雌性小鼠与24只健康雌性小鼠同笼饲养15 d，结果发现仅在一只健康小鼠体内分离到布鲁菌，说明布鲁菌可以在小鼠间经直接接触传播，但传播效率较低，为1/24 (4.2%)。

4 布鲁菌病的诊断

分离培养布鲁菌是布鲁菌病诊断的金标准[16]。然而，血培养结果常常不太稳定[17]，不同种属的布鲁菌生长状况存在差异。骨髓培养结果虽然更为稳定[18]，但需要经历痛苦的机体侵入性取样过程。而且，培养鉴定周期需要耗时3～42 d不等，不适合做早期快速诊断。因此，急需寻找新的诊断方法。

免疫学检测是非常有效的方法，常用的有两种，一是基于识别表面抗原的血清凝集试验，二是基于识别抗原/抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)。两种方法敏感性和特异性均高于85%。血清凝集试验的局限性是在一些特殊情况下，如血清转化滞后、出现抑制性抗体或前带现象，可能会导致假阴性或假阳性结果。ELISA方法则更加快速、特异、敏感，已成为国际贸易中指定的诊断方法，可分为双抗夹心法(常用于大分子抗原检测)、竞争法(常用于小分子抗原检测)和间接法(常用于抗体检测)。一些学者还开发了基于胶体金或量子点的免疫层析快速诊断技术[19-20]，具有操作简单、无需复杂设备、快速便捷的优点，非常适合流行病学调查和现场快速初筛。然而，由于抗体形成后并非长期存在，因此免疫学检测无法应用于患者定期复查或者复发检测中。

在分子诊断技术中，实时荧光定量PCR技术是应用最为广泛的，具有快速(<1h)、极其敏感和特异的优点。美军采用该方法建立了包括布鲁菌在内的多种重要生物威胁病原体的现场快速检测技术。同时，伴随着核酸自动提取技术、微流控技术和基因芯片技术[21]的兴起，未来PCR技术完全可以实现无人高通量智能检测[22]。

5 布鲁菌实验室感染事件

在现代化城市里，公共卫生体系较为完善，奶制品强制进行巴氏消毒，动物检疫也较为严格，因此布鲁菌病是一种很少能接触到的疾病。但在实验室感染事件中，布鲁菌却是常见的病原体，约2%的布鲁菌感染病例来源于实验室感染[23-27]。1988年，美国一家微生物实验室8名实验人员莫名感染布鲁菌，已排除人传人、食源和水源感染的可能性，经过一系列调查，最终发现与6周前解冻的一份病人样本培养物并未在生物安全柜内进行传代培养有关，很可能是实验过程中产生的生物气溶胶被实验人员吸入所致[28]；1990年，意大利萨萨里大学微生物实验室在转移布鲁菌样本时，意外导致离心管破碎，导致12人感染[4]。2004年，一项研究发现土耳其一家医院实验室55名实验人员中有12名感染了布鲁菌，经调查分析估算出每名实验人员每年的感染概率为8%[29]。2010年，我国东北某大学采用未经检疫的山羊进行教学实验，最终导致28名师生陆续确诊感染布鲁菌[30]；2019年，我国某生物药厂在布鲁菌疫苗生产过程中使用过期消毒剂，致使生产发酵罐废气排放灭菌不彻底，携带含菌发酵液的废气形成含菌气溶胶，随风飘散，被人体吸入或黏膜接触导致大量学生检出抗体阳性[31]。

布鲁菌实验室感染事件时有发生，分析总结实验室存在暴露风险的主要原因如图1所示，具体为以下5点：1)实验人员不清楚样本可能含有布鲁菌，仅在普通实验环境下操作样本[32]；2)实验人员培养出菌落后，不了解布鲁菌菌落形态或者革兰染色结果模棱两可，当成是一般病原进行处理[33-34]；3)一些商业化生化检测试剂盒如API20NE，可能将布鲁菌误检为苯丙酮酸莫拉菌或苯丙酮酸冷杆菌[35]；4)未按标准操作规程操作。在布鲁菌的常规实验操作过程中，如悬液制备、离心、旋涡震荡、传代培养和生化试验，特别是过氧化氢酶试验，若不加注意，均有可能产生生物气溶胶。特别是一些误操作导致的实验室事故，如离心管破碎[4]、培养物跌落、逸洒[33]，造成的实验室暴露感染风险更大；5)实验室管理把关不严。如使用未经检疫或来源不明的实验动物，实验设备未进行定期检修维护，消毒措施不当导致消毒不彻底等。

图1 布鲁菌实验室暴露风险因素

6 布鲁菌实验室管理措施

根据《人间传染的病原微生物名录》，布鲁菌活菌操作及动物感染实验需要在生物安全三级实验室中进行，样本检测需要在生物安全二级实验室中进行。由于缺乏系统性的评价体系，实验室的暴露风险是很难进行定量的，仅能依靠案例教育和定期检查降低风险。一项西班牙国家调查发现实验室风险与每年布鲁菌相关的实验量有关，而且多数感染案例都是实验人员未遵守生物安全操作规范导致的[36]。

通过分析众多实验室暴露感染案例，对预防实验室感染布鲁菌提出如下建议：

1)很多实验人员对其操作病原感染后的表型症状并不了解，这是导致实验室感染发生后无法及时发现的重要原因之一[37]，应对实验人员进行定期培训，包括布鲁菌的健康危害、感染途径、传播方式和感染后症状表现等，可通过简报宣传、公众号推文和专家讲座等方式开展。

2)完善送样人员与实验人员的沟通协调机制。送样人员需告知样本来源，对于具有潜在布鲁菌阳性风险的样品应对实验人员进行警示强调，以便选择合适的防护等级。

3)加强实验室安全管理，制定标准操作规范，并确保管理人员和实验人员严格执行，开展实验安全风险评估，定期进行自检、抽检[38]。

4)在处理所有革兰氏阴性菌或难以确定革兰氏染色结果的杆菌或球杆菌时，均需在生物安全柜中操作，除非已经排除布鲁菌[32]。

5)布鲁菌培养器皿在不使用时应该密封，妥善放置以确保安全，防止跌落逸洒。实验结束时，应及时高压灭菌。

6)当检测结果疑似为布鲁菌时，分离物应立即转至生物安全三级实验室进行下一步工作。

7)布鲁菌的抗生素敏感性试验没有意义，因为布鲁菌病的治疗有明确的标准化规程。不建议进行药敏试验或者其他非必要测试，特别是可产生气溶胶的实验[8]。

8)如果在生物安全柜外发生意外逸洒，应立即疏散实验室人员，关闭实验室门，并由经良好培训的且个人防护装备穿戴齐全的人员消毒和净化实验室[4]。

9)若实验人员出现不明原因发热，应立即进行身体健康检查，鉴定布鲁菌感染的可能性。

10)一旦发现实验室感染，应立即彻底调查事件情况，评估人员暴露风险，对暴露人员进行抗生素药物预防。同时修订完善标准操作规程，加强人员管理培训。

对于潜在接触过布鲁菌的实验人员做如下建议：

1)对于直接操作或处理过阳性培养物的人员，应立即隔离，由职业医师监护观察至少6个月。同时，这些人员要立即接受为期3周的预防性抗生素治疗(口服强力霉素100 mg一天2次，利福平600 mg一天1次)[27]。研究表明，预防性抗生素治疗可以极大降低潜在暴露感染者的发病几率[4,27]。随后应进行定期诊断检查以确定是否发生布鲁菌感染，前三个月的检查可以每周1次或者每周2次，之后可以每月检查1次。

2)对于未直接接触过阳性培养物的其他人员，需采取本底血液样本由职业健康部门存储，在征得人员同意的情况下开展血液检测；由于这类人员感染风险较小，不建议进行预防性抗生素治疗，除非某些人员特别担心自己感染的可能性，在签署同意书后可开展治疗。

7 小结

布鲁菌病是一种古老的、全球普遍存在的人兽共患传染病，给人类健康和畜牧养殖业带来严重危害。全世界感染患者约有500万-600万人，每年新增患者约50万人[39]。布鲁菌极易气溶胶化，经呼吸道感染是其主要感染途径之一，而实验室是样本检测和细菌分离培养的场所，实验操作极易产生气溶胶而给实验人员带来暴露感染风险。通过分析过往案例中的经验教训，不断制定完善预防控制措施，并确保管理人员及实验人员严格执行，可以将风险降到最低[38]。本研究提出的部分实验室管理措施不仅对预防布鲁菌，对于预防其他人兽共患病的实验室获得性感染也同样具有借鉴意义。