王利利，张凯睿，范云鹏，刘迎秋，麻武仁，张为民，宋晓平

(西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100)

随着我国经济的发展，养殖业在大规模的扩增，而由细菌引起的疾病严重制约畜牧业的的发展。其中大肠埃希菌和沙门菌可引起畜禽肠道感染及严重的腹泻性疾病，且这两种致病菌易产生耐药性[1-3]；金黄色葡萄球菌可引起心包炎、皮肤炎、肺炎等多种疾病[4]；链球菌可引起奶牛乳房炎、猪链球菌病等[5-6]。临床上常使用抗菌药防治细菌性感染疾病，但是所带来的药物残留及耐药性也日趋严重，中草药因其资源丰富、不易产生耐药性等优点，成为替代抗生素的重要途径[7]。

鹅掌楸属(Liriodendron)植物是传统的药用植物，具有很高的药用价值。《全国中草药汇编》记载以中国鹅掌楸(Liriodendronchinense)的树皮及树根入药，能够祛风除湿，止咳消喘，用于治疗风湿关节痛，风寒咳嗽等病症[8]。李晓娜等[9]研究表明，北美鹅掌楸(L.tulipifera)叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌等临床分离株有不同程度抑菌；张悦等[10]通过研究6种植物粗提物对大肠杆菌的抑制作用，筛选出鹅掌楸乙醇提取物和水提物的抑制率达到70%以上。现代研究表明，鹅掌楸属植物主要含有生物碱、倍半萜、黄酮、苯丙素等成分，具有抗菌、抗疟疾、抗肿瘤等作用[11]。本试验采用系统溶剂法萃取得到杂种鹅掌楸(L.chinense×tulipifera)叶醇提物的不同部位，并通过琼脂平板法和微量肉汤稀释法检测各部位的抗菌作用，以期为进一步研究和应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物

杂种鹅掌楸树叶，2018年05月11日采自西北农林科技大学南校区鹅掌楸路，清洗后自然阴干，粉碎过20目筛，密封袋保存备用。

1.1.2 试验菌株

大肠埃希菌 ATCC25922、沙门菌 CMCC(B)50071、金黄色葡萄球菌 ATCC6538、无乳链球菌 ATCC12386，由西北农林科技大学动物医学院微生物实验室提供；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌临床分离株，从患子宫内膜炎奶牛子宫分泌物中分离得到；沙门菌临床分离株，由华中农业大学动物医学院提供。

1.1.3 主要试剂

无水乙醇(批号2019041002)，石油醚(批号2019041701)，乙酸乙酯(批号2018011001)，正丁醇(批号2019012101)，二甲基亚砜(批号2018042601)，吐温-80(批号201801240)，成都市科隆化学品有限公司；氯仿，批号180030，洛阳昊华化学试剂有限公司；营养肉汤(批号20180330)，营养琼脂(批号20161016)，北京奥博星生物技术有限责任公司；胎牛血清，批号18090505，浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制备

称取杂种鹅掌楸树叶粉末200 g，置于圆底烧瓶中，使用体积分数95%的乙醇加热回流提取4次，每次2 h，药渣用60%的乙醇提取2次，每次2 h，过滤合并滤液，减压浓缩，得醇提浸膏57.15 g。浸膏用适量水分散，依次用石油醚(60～90 ℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～4次，每次3～4 h，减压浓缩并回收各部位溶剂，干燥后分别制得各部位提取物[12]。其中石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物分别为9.25、2.11、1.65、10.25及25.20 g。石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物用3% DMSO和3%吐温-80溶解，水部位提取物用蒸馏水溶解，在超净工作台中过 0.22μm 微孔滤膜，分别配成质量浓度为 10 mg/mL 的药液。干净玻璃棒分别蘸取各药液，点在pH试纸的中部，待试纸变色后，经与标准比色卡比较，各药液pH值均在6～8之间。

1.2.2 体外抗菌试验

供试菌液的制备:在超净工作台中，使用接种环将大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌接种于普通营养琼脂培养基中，链球菌接种于含血清的营养琼脂培养基中，37 ℃恒温培养18 h，然后挑取大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的单菌落接种于无菌普通肉汤中，链球菌单菌落接种于在含血清的营养肉汤上，于37 ℃，180 r/min摇床中培养6 h后，用生理盐水将菌液校正至0.5麦氏比浊标准[13]。

抑菌圈的测定:采用琼脂平板打孔法，使用移液枪分别吸取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌受试菌液100 μL，加于普通营养琼脂平板上，链球菌受试菌液 100 μL，加于含血清营养琼脂平板上，迅速用玻璃涂布器在平板上均匀涂布菌液，然后在琼脂平板上均匀打孔，孔径6 mm，孔间距>20 mm，在酒精灯上迅速加热，封底，将鹅掌楸不同部位提取物的受试药液100 μL加入到各个孔中，并设置溶剂对照，于37 ℃恒温培养18 h后，观察结果，每种供试菌抑菌试验重复3次，测量抑菌圈平均值[14]。判定标准：当抑菌圈直径≥20 mm时，表示极度敏感；当15 mm≤抑菌圈直径<20 mm时，表示高度敏感；当10 mm≤抑菌圈直径<15 mm时，表示中度敏感；当6 mm≤抑菌圈直径<10 mm时，表示低度敏感或者耐药[15]。

最小抑菌和杀菌浓度的测定:采用微量肉汤稀释法测定鹅掌楸不同部位提取物的供试药液对不同菌株的最小抑菌浓度(MIC)。具体方法是：使用营养肉汤将菌液稀释100倍[16]，然后接种于96孔培养板的1～10 孔，每孔接种100 μL，之后将供试药物加至第1孔，吹吸几次，使孔内溶液混匀，吸出100 μL加至第2孔，依次进行倍比稀释，最后第9 孔中吸出100 μL弃掉。其中第10孔加入100 μL 3% DMSO和3%吐温-80，混匀后吸出100 μL弃掉，作为溶剂对照，第11孔为只加营养肉汤100μL的对照孔，检测培养基是否污染，第 12 孔为只加菌液的对照孔，检测菌液是否生长良好，重复3次[17]。接种完成后，置于37 ℃培养箱中培养18 h，观察其MIC，每孔加入5 μL 4% TTC，放置一段时间，观察各孔是否变红，未变红的最后一孔的浓度为最小抑菌浓度。将最低抑菌浓度以上的几个浓度细菌接种到固体培养基上培养过夜，观察，菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度(MBC)[18]。

2 结果

2.1 杂种鹅掌楸体外抑菌圈直径测定

鹅掌楸石油醚部位提取物对沙门菌、金黄色葡萄球菌参考菌株有中等抗菌作用，抑菌圈直径分别为 11.0、10.0 mm；氯仿部位提取物对沙门菌、金黄色葡萄球菌、链球菌参考菌株有强抗菌作用，抑菌圈直径分别为18.0、16.0、17.0 mm；乙酸乙酯部位提取物对沙门菌参考菌株有中等抗菌作用，抑菌圈直径为10.0 mm；石油醚、氯仿、乙酸乙酯部位提取物对大肠埃希菌参考菌株，乙酸乙酯部位提取物对金黄色葡萄球菌、链球菌参考菌株，正丁醇、水部位提取物对 4 种供试参考菌株均无抑菌作用，抑菌圈直径为 6.0 mm(表1)。

表1 杂种鹅掌楸部位提取物对参考菌株的抑菌圈直径 (mm)

鹅掌楸氯仿部位提取物对沙门菌临床分离株有中等抗菌作用，抑菌圈直径为11.0 mm；对金黄色葡萄球菌、链球菌临床分离株有强抗菌作用，抑菌圈直径分别为15.0、16.0 mm；氯仿部位提取物对大肠埃希菌临床分离株，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物对 4 种供试临床分离株均无抑菌作用，抑菌圈直径为 6.0 mm(表2)。

表2 鹅掌楸部位提取物对临床分离菌株的抑菌圈直径 mm

2.2 鹅掌楸各部位提取物最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

石油醚部位提取物对大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、链球菌参考菌株的MIC分别为5、1.25、1.25、2.5 mg/mL，MBC分别为5、2.5、2.5、2.5 mg/mL；氯仿部位提取物MIC分别为5、0.625、0.312 5、0.625 mg/mL，MBC分别为5、1.25、0.312 5、1.25mg/mL；乙酸乙酯部位提取物MIC均别为2.5 mg/mL，MBC 分别为 2.5、5、5、5 mg/mL(表3)。

表3 鹅掌楸部位提取物对参考菌株的MIC和MBC mg/mL

石油醚部位提取物对大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、链球菌临床分离株的 MIC分别为 5、2.5、1.25及2.5 mg/mL，MBC分别为 5、5、2.5及2.5 mg/mL；氯仿部位提取物MIC分别为 5、1.25、0.312 5、0.62 5 mg/mL，MBC分别为 5、2.5、0.312 5及1.25 mg/mL；乙酸乙酯部位提取物 MIC分别为 2.5、5、1.25、2.5 mg/mL，MBC分别为 2.5、5、5及5 mg/mL(表4)。

表4 鹅掌楸部位提取物对临床分离菌株的MIC和MBC mg/mL

3 讨论

中药化学成分及其复杂，每味中药都含有多类化学成分，在进行中药活性成分提取时，通常依据相似相溶的原理来制备提取物[19]。杨国旭[20]对杂交鹅掌楸茎皮的醇提物进行了不同溶剂溶解分段，并证明了杂交鹅掌楸茎皮的二氯甲烷粗提部分对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，抑菌率48.8%。赵亚琦等[21]用琼脂稀释法检测鹅掌楸树皮及叶片提取物抑菌作用，结果表明鹅掌楸树皮和树叶提取物对大肠埃希菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和粪链球菌有明显抑菌效果。另有研究表明，鹅掌楸心材的醇提物以及番荔枝碱(anonaine)和鹅掌楸碱(liriodenine)等对多种细菌具有抑制作用[22-23]。

本试验通过杂种鹅掌楸叶各系统提取物的抗菌作用研究，发现杂种鹅掌楸叶提取物对沙门菌、金黄色葡萄球菌、链球菌有不同程度的抗菌作用，其中氯仿部位提取物作用最强，对沙门菌、金黄色葡萄球菌、链球菌有强抗菌作用，说明其抗菌活性成分属于极性较小的化合物；石油醚和乙酸乙酯部位提取物对沙门菌、乙酸乙酯部位提取物对金黄色葡萄球菌有中等抑菌作用，说明石油醚和乙酸乙酯部位也含有抗菌活性成分。对于试验中出现抑菌圈与MIC结果不一致的原因，分析可能是因为药物经稀释后，抑菌效果有些减弱的快，有些减弱的慢，另外发挥抑菌作用的化学成分在结构上也不相同，导致在肉汤或琼脂中扩散速度不同，在后续研究中，将对氯仿活性部位进行分离纯化，以期为杂种鹅掌楸叶抗菌成分的研究及应用提供参考依据。