雷宇杰,刘开放,黄荣静,李峥*

(1. 信阳农林学院，河南 信阳 464000；2. 河南省现代渔业生物工程技术研究中心，河南 信阳 464000)

茶多酚(tea polyphenols，TP) 又名茶单宁、茶靴质，是茶叶中多酚类物质的总称。茶多酚为淡黄至茶褐色略带茶香的水溶液、粉状固体或结晶，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯，微溶于油脂[1-2]。耐热性及耐酸性好，在pH2～7范围内均十分稳定。茶多酚具有抗氧化作用、增强免疫、预防疾病、提高应激等作用，在各个领域已被广泛应用[3-5]。近年来，茶多酚作为饲料添加剂在水产动物的研究受到学者们的关注。梁高杨等[6]在饲料中添加200～400 mg/kg茶多酚饲喂奥尼罗非鱼，能显著提高其免疫性能，降低嗜水气单胞菌攻毒后的死亡率，对生长性能没有显著影响；徐奇友等[7]在饲料中添加25～100 mg/kg茶多酚饲养虹鳟，显著提高了肝脏免疫酶活性；龙萌[8-9]等用含50～100 mg/kg茶多酚的饲料饲喂团头鲂幼鱼，显著提高了增重率和肝脏抗氧化能力，并降低了鱼体感染嗜水气单胞菌后的死亡率。

马口鱼(Opsariichthysbidens)俗名花杈鱼、桃花鱼，为小型杂食性经济鱼类，游动敏捷，善跳跃，是城市休闲渔业特别是“黑坑”主要引进的品种。马口鱼的研究主要集中在规模化人工繁殖技术上[10-12 ]，对于养殖中出现的疾病防控研究几乎没有。受水体污染及高密度养殖等环境应激的胁迫，如何提高马口鱼免疫力已成为现代水产养殖特别是集约化养殖考虑的焦点问题[13-15]。本试验选用马口鱼作为研究对象，在饲料中添加不同水平的茶多酚，考察其对马口鱼生长性能、免疫性能及环境胁迫下抗病力的影响，为茶多酚在马口鱼的养殖及茶叶的利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

在基础饲料中分别添加0(对照组)、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g/kg的茶多酚，共配成6种试验饲料。基础饲料见表1。

1.2 试验鱼与养殖管理

养殖试验在校外实训基地东双河养殖专业合作社的户外池塘进行，设置18口网箱于塘内，每个网箱的规格为120 cm×120 cm×140 cm，试验所用马口鱼购于开平市水口镇红花鱼苗场。正式试验前，将马口鱼暂养于大网箱中，期间投喂基础饲料使其适应试验环境。驯养2周后，选取体格健壮、规格均一、平均体质量为(7.5±0.3)g的马口鱼360尾进行试验，随机分成6组，每组3个重复，每个重复20尾鱼。养殖试验的18口网箱置于一个池塘中，养殖周期为8周。养殖期间定时饱食投喂3次，每日观察并记录鱼摄食和死亡情况，根据水温、摄食情况进行调整，使各网箱投喂饲料均能保证在15 min内吃完，无残饵。试验期间水温为21～35 ℃，pH值为7.0左右，溶解氧含量大于5.5 mg/L，氨氮含量小于0.01 mg/L。

1.3 样品采集

养殖试验结束后将鱼饥饿24 h，以排空肠道内容物，对每个网箱试验鱼尾数统计并称重，统计每组的成活率、增重率。

表1 马口鱼基础饲料配方和营养水平(干物质) %

注：①饲料原料购自开封海大饲料公司，原料中粗蛋白含量如下：鱼粉64.24 %，豆粕44.16 %，菜籽粕35.65 %，米糠12.69 %，次粉14.28 %，玉米9.2 %；

②维生素预混料为每千克饲料提供：维生素A为10 mg，维生素D3为4 mg，维生素E为250 mg，维生素k3为19 mg，维生素B1为20 mg，维生素B2为20 mg，维生素B3为45 mg，维生素B5为50 mg，维生素B6为30 mg，叶酸为3 mg，维生素B12为0.05 mg；

③矿物质预混料为每千克饲料提供：锰200 mg，铁为450 mg，锌150 mg，铜30 mg，镁150 mg，碘4 mg。

血清采集：每口网箱随机取4尾马口鱼，用一次性1 mL的无菌注射器尾部静脉采血，置于2 mL离心管内，离心机(3 000 r/min)离心10 min后取上清液，将同一网箱中采集的血清混匀后，分装于0.5 mL的离心管内，每口网箱分装12管血清，保存于-80 ℃冰箱中，用于测定血清指标。

1.4 生长指标

养殖试验结束时，禁食24 h，每尾网箱随机取3尾鱼，测量体重体长，解剖取内脏和肝脏，称重用于计算形体指标。指标计算公式如下：

增重率(WGR，%)=100×(终末均重-初始均重)/初始均重；

成活率(SR，%)=100×终末鱼尾数/初始鱼尾数；

肝体指数(HIS，%)=100×肝脏重/体重；

脏体指数(VSI，%)=100×内脏重/体重；

肥满度(CF，g/cm3)=100×体重/体长3。

1.5 全鱼常规成分分析

将称重的试验鱼，每口网箱随机取3尾鱼，将鱼体称重后置于培养皿中，在105℃的烘箱中烘至恒重后计算得到水分含量(GB 5009.3-2016)；粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法(全自动凯氏定氮仪，kjeltee-2300,福斯有限公司，瑞典)(GB 5009.5-2016)。粗脂肪含量测定采用索氏抽提法(GB 5009.6-2016)；粗灰分含量的测定采用550 ℃马弗炉灼烧法(GB 5009.4-2016)。

1.6 血清免疫指标的测定

血清超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LYZ)、丙二醇(MDA)、过氧化氢酶(CAT)的活性测定使用南京建成生物工程研究所所生产的生化试剂盒测定。

南京建成生物工程研究所试剂盒测定SOD的活性。血清中SOD活力单位定义：每毫升反应液中SOD酶活单位(U)。测定LYZ原理：在一定浓度的混浊液中，由于LZM能水解细菌细胞壁上的肽聚糖使细菌裂解，体系浓度降低，透光度增强，根据透光度变化推测LYZ含量(1 μg=80 U)。MDA含量测定采用黄嘌呤氧化酶法。CAT活性测定采用钼酸铵法。

1.7 攻毒试验

饲喂试验结束后，每组随机选取20尾鱼，每组设置2个重复(10尾/重复)，分别饲养在标记好的小型水族箱中，保持水温恒定。所用试验鱼腹腔注射浓度为50倍半数致死剂量(LD50)(1.57×108CFU/mL)的假单胞菌菌液，每尾0.2 mL。连续观察15 d，记录各组试验鱼的死亡情况，计算存活率。

1.8 统计分析

采用SPSS20.0分析软件对试验所得数据进行单因素方差分析，试验数据用平均值±标准差表示，结合Duncan氏多重比较检验法进行组间差异显著性比较，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 TP对马口鱼生长性能和形体指标的影响

TP对马口鱼生长和形体指标的影响见表2。经过8周的养殖试验，各组试验对象生长良好，没有出现死亡现象。其中0.2、0.4和0.6 g/kg组增重率显著高于对照组和其他试验组(P<0.05)；在形体指标方面，0.2～0.8 g/kg组的肥满度显著高于对照组(P<0.05)，肝体指数和脏体指数各组之间无显著性差异(P>0.05)。

表2 TP对马口鱼生长指标和形体指标的影响

项目指标茶多酚添加量/(g·kg-1)0(对照组)0.10.20.40.60.8初始均重/g7.57±0.127.71±0.067.68±0.117.48±0.077.45±0.217.54±0.05终末均重/g33.78±6.0335.33±3.8340.83±7.5239.27±8.8139.01±3.2735.89±4.34增重率/%346.24±2.56a358.23±2.31ab431.64±3.36c425±4.43c423.62±2.06c373.34±3.04b成活率/%100100100100100100肝体指数/%1.83±0.181.88±0.031.80±1.011.84±0.081.84±0.061.85±0.07脏体指数/%7.29±0.137.28±0.097.32±0.087.33±1.127.29±0.177.31±0.56肥满度/g/cm31.34±0.08a1.35±0.07a1.42±0.13b1.43±0.13b1.43±0.09 b1.42±0.11b

注：同一行数据上标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同

2.2 TP对马口鱼体成分的影响

TP对马口鱼体成分的影响见表3。与对照组相比，饲料中添加TP可降低体组织中脂肪的含量，特别是0.2 、0.4、0.6和0.8 g/kg组降低较为显著(P<0.05)。全鱼水分、粗蛋白含量和粗灰分含量各组之间无显著差异。

表3 TP对马口鱼体成分的影响

项目指标茶多酚添加量/(g·kg-1)0(对照组)0.10.20.40.60.8水分76.22±0.1376.98±0.2277.03±0.2576.58±0.3676.48±0.1777.13±0.28粗蛋白质18.36±0.1518.72±0.1418.66±0.1818.48±0.2218.76±0.0817.98±0.31粗脂肪1.81±0.21a1.70±0.11ab1.65±0.13b1.63±0.18b1.62±0.23b1.60±0.28b粗灰分1.28±0.081.29±0.971.30±0.231.29±0.731.28±0.321.29±0.19

2.3 TP对马口鱼血清免疫指标的影响

TP对马口鱼血清免疫指标的影响见表4。与对照组相比，饲料中添加0.4、0.6和0.8 g/kg TP均能显著提高SOD、CAT、LYZ的活性；血清中MDA含量则出现先降低后升高的变化，其中以0.4 g/kg组变化最为明显。

表4 TP对马口鱼血清免疫指标的影响

项目指标茶多酚添加量/(g·kg-1)0(对照组)0.10.20.40.60.8SOD(U/mL)60.56±1.23a82.45±0.56b103.21±1.86c110.78±2.13c106.25±2.57c98.73±3.91bcCAT(U/mL)1.56±0.23a2.05±0.09b 2.06±0.36b 3.28±0.56c 3.3±0.63c3.53±0.49cLYZ(U/mL)106.67±1.23a 168.58±2.45b 179.79±2.56b199.87±4.21c203.82±2.59c208.95±2.16c MDA(nmol/mL)9.56±1.11a8.82±0.94ab 7.21±1.72b 6.89±1.62c 6.56±1.42c6.62±0.95c

2.4 TP对病原菌感染后马口鱼死亡率的影响

病菌感染试验结果显示(图1)，6组试验对象的存活率在第15天时存活率分别为5%、30%、55%、55%、60%和60%，5个试验组的存活率与对照组相比差异显著(P<0.05)。

图1 攻毒后各组的存活情况

3 讨论

3.1 TP对马口鱼生长性能和体成分的影响

目前，TP作为食品添加剂和饲料添加剂被广泛应用于各个行业，近年来在水产养殖上也受到重点关注。在茶多酚能否促进鱼体生长，各研究者的结果不一：徐禛等[16]用儿茶素饲喂草鱼，对草鱼的生长没有显著影响，但增加了其肥满度；梁高杨等[6]在饲料中添加100～800 mg/kg茶多酚后，结果发现对罗非鱼生长性能无显著影响；龙萌等[8]发现饲料中添加50 mg/kg和100 mg/kg茶多酚，显著提高团头鲂增重率和特定生长率；刘振兴等[17]发现饲料中添加166 mg/kg茶多酚可显著提高罗非鱼的生长性能；同样地，李金龙等[18]在饲料中添加50 mg/kg茶多酚，可显著提高青鱼的生长性能。

本试验中，在饲料中添加0.1～0.8 g/kg茶多酚后，结果发现其特定生长率出现先增高后降低的趋势，且在0.8 g/kg添加组较在0.2～0.6 g/kg添加组显著下降，这说明一定剂量的茶多酚可以促进马口鱼的生长。对比其他学者的研究，茶多酚在促进鱼类生长性能的研究结果中各有差异，分析这可能与鱼的种类、饲料、茶多酚的含量等各方面有一定的关系。肥满度指标可以衡量鱼体的生长及营养健康情况，也是检查鱼体对外界环境的适应能力和饲料饲喂效果的的重要方法。本试验马口鱼的肥满度指标与增重率呈正相关关系，在一定程度上，也验证了TP可以促进生长性能的提高。通过体成分的分析，0.1～0.8 g/kg的TP可显著降低体组织中脂肪的含量，从另一个侧面验证了TP添加可促进鱼体健康水平。通过对这三个指标的判定，初步认为马口鱼饲料中TP的适宜添加水平为0.2～0.4 g/kg。

3.2 TP对马口鱼抗氧化性指标、非特异性免疫指标及抗病力的影响

鱼类和人类一样，在呼吸和代谢过程中会产生氧自由基，及时清理机体过量自由基可降低机体的氧化损伤程度，SOD、CAT是机体重要的抗氧化能力酶，在机体的氧化和抗氧化平衡中发挥重要作用。本试验中，添加0.4、0.6和0.8 g/kg均能显著提高SOD、CAT的活性。MDA为机体内脂质过氧化的产物，其含量的多少能间接反映出氧自由基的含量及机体细胞脂质过氧化的程度。随着TP添加水平的提高，斑点叉尾鮰[19]、草鱼[16]等的血清中MDA均呈下降趋势。本试验中，添加0.4～0.8 g/kg TP可显著降低马口鱼血清中MDA含量，与上述的研究结果相一致。LYZ是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，从而起到抗菌效果。体内LYZ活性是鱼类非特异性免疫的重要指标，有助于鱼类抵抗水域中各种病原的侵袭。梁高杨等[6]在饲料添加200～800 mg/kg的茶多酚显著提高了奥尼罗非鱼血清中LYZ活性；在饲料中添加1%～5%绿茶提取物，增强了许氏平鮋血浆中LYZ活性[20]。本试验中，添加0.4～0.8 g/kg能显著提高机体的LYZ活性，提高鱼类的免疫力。以上4个指标的测定结果显示，TP对马口鱼血清中抗氧化指标和免疫力提高是显著的，后期进行的攻毒试验表明，0.2～0.8 g/kg的TP添加量组存活率显著高于对照组，这些研究结果说明TP的添加可以提高鱼体抗氧化能力和非特异性免疫，同时可提高对病原菌的抑制作用。

4 结论

在基础饲料中添加TP可促进马口鱼的生长，增强鱼体抗氧化能力和抗病原菌的感染力。综合生长性能和抗病力分析，马口鱼幼鱼饲料中茶多酚适宜添加量为0.2～0.4 g/kg。