姚志浩，梅文晴，冯宇妍，倪迎冬

(南京农业大学农业部动物生理生化重点开放试验室，江苏 南京 210095)

B族维生素是水溶性维生素，包括B1、B2、烟酸、泛酸、B6、B12等，是维持细胞正常生理功能和特定代谢反应所必需的微量低分子有机化合物。一般来说，B族维生素在大多数动物体内是不能合成，必须通过饮食的摄入获得。而反刍动物瘤胃中合成的B族维生素可以满足其营养需求，即使日粮中不含B族维生素，只要瘤胃功能正常，瘤胃微生物合成的B族维生素也足以避免缺乏症的发生[1]。然而，近年来的研究表明，在奶牛中添加VB3和胆碱可以提高奶牛的产奶量和乳脂率，日粮中添加VB1可以增加或倾向于增加牛奶和成分的产量[2-4]。从而提示：在瘤胃中合成的B族维生素不能满足反刍动物的营养需求。特别是幼年反刍动物，因其瘤胃尚未完全形成一个完整的微生态系统，对粗饲料的利用率较低，更需要在日粮中补充一定量的维生素B[5]。

哺乳动物的肠道内寄居着数万亿微生物，统称为微生物群落。肠道菌群的稳态决定其黏膜屏障的完整性与机体健康，而肠道的发育及其功能对动物的健康和生长具有重要作用，如何促进肠道的发育完善便成为了提高生产性能的关键因素[6]。研究表明，维生素B12可以调节酶的活性，阻止肠杆菌科细菌的快速生长，而且B族维生素补充剂可能对肠道疾病有一定的预防作用[7-8]。

目前，有关日粮中补充复合维生素B对生长期山羊生长性能的研究较少，最佳添加剂量尚未见报道。有关复合维生素B对山羊肠道菌群组成的影响研究亦未见报道，而肠道菌群对黏膜屏障的完整性及生长性能都具有重要作用。因此，本研究旨在探讨添加不同浓度的复合维生素B对生长性能和肠道微生物菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物与日粮

选取20只3-4月龄(16.78±1.52)kg的波杂雌山羊作为试验动物。试验开始前预饲2周，试验期为56 d，精饲料和粗饲料的比例为40∶60，中剂量复合维生素B的补充浓度参考之前研究中的饲料配方中的添加剂量[9]。复合维生素B(河北某兽药业有限公司)包括维生素B1、B2、B6、B12、B3和B5。在精料(南京青龙山饲料营销部)中分别添加0 mg/kg复合维生素B(对照组，C)；低剂量复合维生素B，含1.2 mg/kg维生素B1、2.4 mg/kg维生素B2、2.4 mg /kg维生素B3、2.4 mg /kg维生素B5、1.2 mg/kg维生素B6、8 μg/kg维生素B12(低剂量组，L)；中剂量复合维生素B，维生素B添加剂量为低剂量组的5倍(中剂量组，M)；高剂量复合维生素B，维生素B添加剂量为低剂量组的10倍(高剂量组，H)。日粮组成及营养成分见表1。在试验期间，自由采食饮水，每日于8：00和16:00时饲喂。

表1 日粮组成及营养水平

原料营养水平精粗比40∶60净能量/(MJ·kg-1)8.23苜蓿青贮/%60粗蛋白/%3.84玉米/%22.4粗脂肪/%1.09麸皮/%4.8中性洗涤纤维/%34.94豆粕/%10.8酸性洗涤纤维/%24.59小苏打/%0.4钙/%0.90预混料/%1.6磷/%0.33总计100

注:预混料是由同一类的多种添加剂或不同类的多种添加剂按一定配比制作而成的匀质混和物，每千克预混料为日粮提供：VA 110 kIU, VD 65 kIU, VE 320 IU, 铜 460 mg, 铁 1 900 mg, 锌 1 800 mg, 锰 1 600 mg, 碘 30 mg, 钴 15 mg, 锡 6 mg,食盐 160 g;营养水平是指日粮中营养成分的含量,本试验中均为计算值。

1.2 样品采集

分别于试验前(0 d)、试验后第28天和56天称重(禁食一夜)，记录每日采食量。由于低剂量组较对照组无明显变化，且VB添加量较低，因此仅对对照组、中剂量组和高剂量组进行样品采集及相关指标的检测。采集颈静脉血液并制成血浆备测。4 ℃，3 500 r/min离心15min，将分离的血浆放于EP管中储存在-20 ℃和-80 ℃冰箱内。试验结束时采集新鲜粪便，置于液氮中保存，用于16S rRNA扩增子测序。

1.3 粪便16S rRNA基因扩增子焦磷酸测序

采用CTAB或SDS方法对样本的基因组DNA进行提取。进行PCR扩增和产物的混样和纯化，使用Ion S5TMXL进行上机测序。将得到的原始数据(Raw reads)进行拼接过滤得到最终的有效数据(Clean Reads)。利用Uparse软件对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)，对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA132的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。使用MUSCLE软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs序列的系统发生关系。最后对各样品的数据进行均一化处理，以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。

1.4 血液生化指标检测

血浆总胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、甘油三酯(TG)和葡萄糖(GLU)使用全自动生化分析仪(7020，日立，东京，日本)测量。

1.5 血浆维生素B浓度的测定

血浆中维生素含量采用山羊维生素B酶联免疫分析试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司)进行检测，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。血浆中VB1和VB2的含量采用HPLC方法(苏州科铭生物技术有限公司)进行检测。

1.6 统计分析

试验数据用Mean±SEM表示。采用SPSS18.0 统计软件，对数据的差异性进行独立样本t检验，将P<0.05视为差异显著，P<0.01视为差异极显著。对于C、M和H组的物种丰度和ACE指数等，用其相对丰度与饲料中复合维生素B的剂量进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同剂量复合维生素B对山羊体重、采食量和料重比的影响

从表2中可以看出，在试验期间各组山羊体重无显著变化(P>0.05)。与C组相比，H组增重在第56天显著升高(P<0.05)，但L和M组无显著变化(P>0.05)；在试验第56天时H组的料重比显著低于C组(P<0.05)，但与L和M组相比，C组无显著变化(P>0.05)。由图1可知，在试验期间各组山羊的采食量无显著变化(P<0.05)。

表2 复合维生素B对山羊体重、增重和料重比的影响

项目C组L组M组H组第1天体重/kg17.56±0.4016.02±0.4316.78±0.8716.76±0.90第28天体重/kg20.76±0.3419.08±0.5820.26±1.0320.34±0.87第56天体重/kg23.76±0.2722.26±0.4423.28±0.9223.42±0.94总增重/kg6.20±0.13b6.24±0.17ab6.50±0.09ab6.66±0.11a料重比13.14±0.29a12.87±0.30ab12.49±0.15ab12.20±0.15b

注：相同指标不同组别比较，字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同

图1 复合维生素B对山羊采食量的影响

2.2 复合维生素B对山羊血液生化指标的影响

从表3可知，H组血浆中总蛋白和球蛋白水平较C组明显降低(P<0.01)，而山羊白蛋白浓度无变化(P>0.05)。同时，与C组相比，H组山羊血浆总胆固醇水平明显降低(P<0.05)。M组血浆中各种血液生化指标相比C组均无显著变化(P>0.05)。

2.3 复合维生素B对山羊血浆维生素B含量的影响

由图2a和2b可知，与对照组相比，H组血浆VB1和VB2的含量略有升高但无显著差异(P>0.05)。从图2c可以看出，H和M组血浆维生素B的浓度相比对照组显著升高(P<0.05)。

2.4 复合维生素B对山羊粪便中微生物多样性的影响

通过对山羊粪便中细菌16S rRNA基因的焦磷酸测序分析，得到H、M和C组OTU的序列数分别为83321、84469和85798个。从图3A和3B中可以看出，随着测序深度的增加，复合维生素B的添加剂量越高则物种的丰度越低。从表4中可以看出在C、M和H组的物种丰度及ACE指数中，H组显著高于C组，且物种丰度和ACE指数与复合维生素B的浓度呈负相关。

表3 复合维生素B对山羊血液生化指标的影响

参数 C组M组H组总蛋白/(g·L-1)84.74±3.09a78.02±0.64ab73.50±3.33b白蛋白/(g·L-1)22.98±1.3824.14±0.6024.82±0.51球蛋白/(g·L-1)61.76±3.94a54.28±0.84ab48.68±3.49b总胆固醇/(mmol·L-1)1.53±0.04a1.47±0.05ab1.34±0.06b甘油三酯/(mmol·L-1)0.18±0.0250.23±0.0380.23±0.037乳酸脱氢酶/(U·L-1)279.20±17.21275.20±13.90299.60±20.04葡萄糖/(mmol·L-1)3.15±0.193.45±0.043.53±0.11高密度脂蛋白胆固醇/(mmol·L-1)0.95±0.081.03±0.060.91±0.02低密度脂蛋白胆固醇/(mmol·L-1)0.43±0.030.51±0.030.44±0.07

注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)

图2 复合维生素B对山羊血浆中VB1(a)、VB2(b)和总VB(c)含量的影响

注：稀释曲线中，横坐标为从某个样本中随机抽取的测序条数，纵坐标为基于该测序条数能构建的OTU数量，用来反映测序深度情况，不同的样本使用不同颜色的曲线表示；等级聚类曲线中，横坐标为按OTUs丰度排序的序号，纵坐标为对应的OTUs的相对丰度，不同的样本使用不同的颜色的折线表示。

图3 C、M和H组稀释曲线(A)和等级聚类曲线(B)的比较

表4 粪便微生物α多样性比较

参数C组M组H组相关系数r物种数1 475.00±3.00a1 433.67±9.52ab1 387.00±27.07b-0.999*Simpson指数0.993±0.000.990±0.000.991±0.00-0.655Chao1指数1 734.02±187.081 506.72±11.901 448.60±24.33-0.946ACE指数1 586.27±41.52a1 507.61±10.25ab1 448.81±28.25b-0.997#覆盖度1.00±0.001.00±0.001.00±0.00PD whole tree81.15±1.6079.57±1.0179.76±2.26-0.806

注：r为微生物相对丰度与复合维生素B剂量之间的相关系数；*表示显著相关(P<0.05)，#表示有变化趋势(0.05

2.4 山羊粪便微生物的门水平和种水平的微生物组成

由图4可知，拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)在三组中均为优势菌门，但三组中各优势菌门均无显著差异(P>0.05)。在种水平上，由表5可知，共有4个菌种在种水平上发生显著变化，其中普雷沃氏菌(Prevotellacopri)和多型拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)在H组显著高于C组(P<0.05)。而M和H组瘤胃球菌(Ruminococcusbromii)和大肠杆菌(Escherichiacoli)的相对丰度均显著低于C组(P<0.05)。

图4 复合维生素B对山羊单个样本(A)和组间(B)门水平菌群组成的影响

表5 组间差异显著的微生物相对丰度 %

2.5 粪便菌群组间物种分析t检验

从图5A和5B可以看出，M和H组肠杆菌目的丰度显著低于C组 (P<0.05)。同时，在图5C和5D中，M和H组肠杆菌科的水平也较C组显著下降(P<0.05)。M组的瘤胃球菌科水平也显著低于对照组(P<0.05)。由图5E可知，H组与C组相比，肠杆菌属和产氢厌氧杆菌属的相对丰度显著下降(P<0.05)。而图5F中肠杆菌属的相对丰度中，M组显著低于C组(P<0.01)。由图5G和5H可知，H和M组大肠杆菌的丰度相比对照组显著降低 (P<0.05)。此外，H组的螺旋体的相对丰度较C组也显著降低(P<0.01)。

图5 粪便菌群目(A,B)、科(C,D)、属(E,F)和种(G,H)水平组间物种分析t检验

3 讨论

反刍动物瘤胃内微生物合成的B族维生素可以满足机体的需要，但由于幼龄反刍动物瘤胃发育不完全以及近年来人们对反刍动物产品的要求越来越高，饲粮中补充维生素B用量的研究也越来越多[10-11]。但迄今为止山羊日粮中复合维生素B的适宜添加剂量尚未见报道[12]。在本试验中，随着复合维生素B添加剂量增加，山羊增重也随之增加。同时，有研究表明，在犊牛日粮中补充维生素B对其采食量没有显著影响[13]，这和本研究结果一致。除此之外，在本试验中发现随着日粮中复合维生素B添加剂量的提高，山羊的料重比显著降低，这说明日粮添加维生素B可能对饲料的利用率具有积极作用。

机体是一个大的稳态，当机体发生生理或病理变化时，必定伴随着血液成分的改变。因此，血液指标的检测在临床上具有重要意义。有研究表明维生素B2可以促进胆固醇的代谢[14]，本试验中血浆胆固醇含量的变化可能与此相关，说明补充维生素B可能对机体的代谢具有积极作用。此外，日粮添加维生素B复合物后，血浆总蛋白和球蛋白水平显著下降，这和其他动物上的结果是一致的[15]，提示血浆中总蛋白和球蛋白的含量可能作为补充维生素B的血浆标记物之一。在本试验中发现，饲喂复合维生素B会使山羊血浆中维生素B的含量显著提高，说明山羊可以吸收日粮中添加的维生素B，以满足机体的需求，并不会随尿液和粪便完全排出体外。

有研究表明，补充维生素B会影响肠道微生物组成[16]，这与本试验结果是基本一致的。在本试验中随着维生素B浓度的增加，粪便微生物的物种丰度和ACE指数明显下降，且与复合维生素B的浓度梯度呈负相关，说明反刍动物饲粮中添加维生素B会降低肠道微生物的相对丰度，虽然肠道菌群的丰富度是肠道健康的标志之一，但在本试验中发现肠道菌群丰度的降低主要体现在肠杆菌目水平的降低，其他菌群的丰度变化主要体现在属和种水平，对肠道菌群丰度的影响较小，而有报道指出，在肠道中肠杆菌是合成核黄素的主要菌群[17]。在我们的研究中发现，随着复合维生素B的补充剂量的增高，粪便中H和M组的肠杆菌的丰度和对照组相比在不同水平均显著降低。所以，肠道微生物丰度的降低，可能是由于日粮补充了足够量的核黄素引起的。一些不太常见的细菌，例如诱导纤维吸收和淀粉降解的普雷沃氏菌，其相对丰度也会在补充维生素B后显著升高[18]。本试验中H组粪便中的普雷沃氏菌的相对丰度相对C组显著升高。还有研究表明，人类肠道中编码大量碳水化合物降解活动的多型拟杆菌，其具有在饮食衍生碳水化合物和宿主衍生碳水化合物之间进行转换的能力[19]。拟杆菌也存在有害的一面，当肠道正常的微生态平衡被打破时，可引发内源性感染，因此，多形拟杆菌是否是有益菌，尚存在争议。本试验中H组粪便中其相对丰度相比C组也是显著增加的，这些菌群的增加可能和山羊饲料转化率有密切的联系。与此同时，硫酸盐还原菌如梭状芽孢杆菌科、肠杆菌科、拟杆菌科等与结肠炎的发病机制有关[20-22]，本研究发现这几种菌的相对丰度在饲喂复合维生素B后均显著降低。综上所述，在山羊日粮中补充复合维生素B会显著改善山羊的生长性能，这些变化可能和肠道中菌群的变化有关。

4 结论

本研究表明，在生长期山羊日粮中添加复合维生素B在提高其增重的同时可以降低料重比，且在本试验中高剂量组复合维生素B的效果最佳，这可能与普雷沃氏菌等有益菌丰度的增加而有害菌丰度减少有关，其具体机制还需要进一步的探讨。