付言峰，王学敏，王丽，李悦，方晓敏，任守文

(江苏省农业科学院畜牧研究所/农业部种养结合重点实验室/江苏省农业种质资源保护与利用平台,江苏 南京 210014)

产仔数是养猪生产中一个重要的繁殖性状和经济性状，产仔数受排卵率、受精率、胚胎存活率和子宫容量等一系列因素的影响，其中胚胎存活率直接反映潜在产仔数的多少[1-3]。停育吸收的胚胎一般认定为胚胎死亡，胚胎死亡一个关键时期为胚胎附植期[4-7]，而这些胚胎的死亡是导致产仔数下降的一个重要原因[3,6-7]。此外，猪作为一个良好的动物模型，在研究人类附植障碍疾病(如流产)的过程中也发挥着重要的作用[8]。因此，研究猪胚胎附植的调控机制意义重大。

猪胚胎附植的调控机制目前还不清楚，现已报道一些趋化因子、大分子、蛋白在附植调控中发挥作用[9-10]，例如趋化因子受体- 1 (CXCR-1)[11]、反转录转座子类基因1(retrotransposon like 1, RTL 1)[12]、促红细胞生成素产生肝细胞受体-配体(eph-ephrin) 系统[13]和瘦素基因(leptin or LEP)[14]等。在这些基因中，ephrin A1是Eph-ephrin系统中一对重要的配体基因，此系统通过细胞间通讯在多种发育过程中发挥重要作用，包括细胞迁移、黏附、血管发生和神经元可塑性[15-16]。有研究报道，ephrin A1的mRNA和蛋白在胚胎附植期的人[17-19]、小鼠[20]和猪[13]的子宫内膜和胚胎中均有较高表达。

鉴于ephrinA1基因在猪繁殖过程中的生物学功能，本研究采用Real-time定量PCR(qPCR)和Western blot方法分析了ephrinA1基因在胚胎附植过程中母猪繁殖组织样品中的表达，并分析了其在不同组织间和不同繁殖力母猪之间是否存在差异，且将这些表达差异与繁殖表观性状进行了关联分析。研究结果将有助于人们对进一步了解ephrin A1在胚胎附植后期调控中的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选用24头妊娠第22天的长大二元后备母猪(头胎)，平均体重为(133.76±3.52)kg。将试验猪根据体重平分为2组，分别注射7.5 mL和5 mL PG600，人工授精方式配种，制备不同胚胎数猪，这些猪的饲养条件和环境保持一致。妊娠第24天的猪选用5头本团队自主培育的有完全自己知识产权的国家新品种-苏山猪(第5胎次)，全部采用本交方式配种，这些猪的饲养条件和环境保持一致，配种后统一管理。至妊娠日龄后，均按照本单位规定的实验动物福利与伦理规定进行屠宰，屠宰后立即采集卵巢黄体、子宫内膜附植点、尿囊绒毛膜、胚胎、子宫内膜附植点间、子宫体和子宫颈等繁殖组织样品，液氮保存。

1.2 引物设计

猪ephrin A1(又名EFNA1，GenBank: NM_001123110.1)的Real-time qPCR引物均由Primer Premier 5.0软件设计，引物由ThermoFisher 生物公司合成 (表1)。所有的引物均经过预实验优化，PCR扩增效率均在94%～102%之间。GAPDH为持家基因。

表1 猪ephrinA1基因实时荧光定量PCR分析用引物序列及反应条件

基因名称引物序列(5'→3')退火温度/℃PCR产物长度/bpephrin A1GCAAGGAGTTCAAAGAGGGAC58.8117GAGGACTGTGGGTGATTTTGC59.5CACGACTTCAGGCATATCCC57.7GAPDHCCTGGAGAAACCTGCAAAATA57.4100AACCTGGTCCTCAGTGTAGCC58.2

1.3 总RNA提取、反转录及Real-time qPCR

总RNA采用TRIzol/氯仿方法[21-22]从猪组织样品中提取，之后用检测提取的RNA浓度，再用分光光度计(NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer, USA)和1.5%的琼脂糖电泳检测RNA完整性。总RNA反转录成cDNA是根据First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo, USA)使用说明书进行操作。为减少干扰，每个cDNA样本都稀释10倍(5 μL cDNA + 45 μL H2O)，每个样品做3个重复，并用ddH2O代替cDNA模板做阴性对照，以检测是否有外源DNA污染[23]。

Real-time qPCR以上述cDNA为模板，利用SYBR Green RT-qPCR 试剂盒(ThermoFisher, USA)20 μL PCR反应体系上机(7900HT Fast Real-Time PCR System)试验。反应体系如下：SybrGreen qPCR Master Mix (2×) 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板(cDNA稀释10倍)1 μL, Taq DNA Polymerase 0.3 μL, 加Rnase-free ddH2O到 20 μL。反应程序如下：95℃ 5 min 热启动HotStarTaq酶活性；95 ℃熔解20 s，60 ℃退火25 s ，72 ℃延伸30 s，循环40次；45～95 ℃，读板时0.1 ℃/s 进行溶解曲线分析。GAPDH为持家基因，随机选取部分组织样，用β-actin作第二持家基因进行验证。

1.4 蛋白提取及免疫印迹

蛋白提取使用自配的蛋白裂解液，实验步骤按顺序为：SDS-PAGE、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色(Invitrogen, USA)和化学发光检测试剂盒(Sunbio, 中国)曝光。蛋白提取和实验方法如文献[24]报道。免疫印迹实验所用一抗为稀释1 000倍的鼠抗人抗体(mouse anti-human ephrin A1 mAb, sc-377362, Santa Cruz, USA) ，二抗为：稀释2 000倍的羊抗鼠抗体，辣根过氧化物酶标记(南京凯基生物)。最后使用LabWorks灰度图像软件分析免疫印迹的电泳条带。

1.5 数据统计

基因表达量和繁殖性状之间的关联分析使用SPSS 22.0的“Spearman相关”程序评估；实时荧光定量PCR的数据利用2-ΔΔCt法分析，得到ephrin A1的mRNA 相对表达量，内参基因为GAPDH[25-26]；不同组织间mRNA和蛋白表达量的差异性显著水平通过SAS 8.2统计软件包进行GLM分析，结果以最小二乘均值±标准误(LSmeans±SE)表示。

2 结果与分析

2.1 不同繁殖力母猪的制备效果

利用7.5 mL和5 mL PG600注射诱导生产高胚猪和低胚猪，两组母猪平均体重分别为132.0 kg和135.3 kg，注射后发情间隔分别为4 d和3.8 d，均差异不显著。高胚猪相较于低胚猪，黄体数、总胚胎数和正常胚胎数均显著增加 (P<0.05)，总胚胎数/黄体数极显著下降(P<0.05)。另外，高胚胎猪的胚胎大小(包括平均胚胎重量和胚胎长度)和卵巢大小(包括平均卵巢重量和卵巢面积)小于低胚胎猪，没有显著差异(图1)。

2.2 ephrin A1在附植后期猪繁殖组织的mRNA表达

Real-time qPCR结果表明：妊娠第22天，猪子宫内膜附植点的ephrin A1表达量显著高于尿囊绒毛膜和胚胎(P<0.05)。其中在子宫内膜附植点处，ephrin A1的mRNA表达在高/低胚胎猪间差异不显著；尿囊绒毛膜处，ephrin A1的mRNA表达在高/低胚胎猪间差异亦不显著；但在胚胎处，ephrin A1在高胚猪胚胎中的mRNA表达量显著小于低胚猪(P<0.05)。另外，妊娠猪中ephrin A1的mRNA表达量显著高于空怀猪(P<0.05)(表2)。

妊娠第24天，ephrin A1的mRNA在5种繁殖组织中的表达量差异显著，其中在妊娠猪(3头)子宫内膜附植点的表达量最高(P<0.05)，其次按高到低依次是子宫内膜附植点间、子宫颈、卵巢黄体和胚胎，表达趋势与妊娠第22天的基本一致。另外，妊娠猪中ephrin A1的mRNA表达量显著高于空怀猪(2头)(P<0.05)(图2)。

2.3 ephrin A1在附植后期母猪繁殖组织的蛋白表达

免疫印迹结果表明：在胚胎附植后期的妊娠第24天，ephrin A1蛋白在猪子宫内膜附植点处均有较强表达，其次为子宫内膜附植点间，蛋白表达量最低的卵巢黄体(图3)。ephrin A1蛋白表达曲线与mRNA表达趋势基本一致，表明猪子宫内膜附植点可能是ephrinA1基因的主要靶组织，ephrin A1主要通过这个靶组织参与胚胎附植调控。

2.4 ephrin A1基因mRNA表达水平与繁殖性状间的关联分析

关联分析结果表明，ephrin A1 mRNA表达与胚胎长度呈正相关，相关系数为0.49。 相反，ephrin A1的mRNA表达与总胚胎数(或正常胚胎数)之间存在负相关，相关系数为-0.25。其中，相较于胚胎重、正常胚胎数和卵巢重，ephrin A1表达和胚胎长之间的相关系数最高，与总胚胎数之间的相关系数最低(表3)。

*表示组间比较，差异显著(P<0.05)

表2 妊娠第22天高胚猪和低胚猪繁殖组织样品中的ephrin A1的mRNA表达变化(平均数±标准误)

组织样品nephrin A1高胚猪低胚猪空怀猪T检验(高胚和低胚间比较)子宫内膜附植点54.20±1.34 a6.18±1.45 a 0.14±0.02不显著尿囊绒毛膜53.01±1.34 a3.89±1.44 b不显著胚胎50.72±0.22b4.65±1.81 a P<0.05

注：不同组织样品间小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，空怀猪采集的组织样为子宫内膜

图2 妊娠第24天ephrin A1在猪繁殖组织的相对mRNA表达量

图3 妊娠第22天母猪子宫内膜附植点、附植点间和卵巢黄体组织样品中ephrin A1的蛋白表达量

针对每头猪进行ephrin A1 mRNA表达量和繁殖性状的线性图分析，结果表明： ephrin A1 mRNA表达量在不同猪之间的表达差异不大，而繁殖性状值在不同猪之间则差异明显。进一步证明ephrin A1表达量和繁殖性状间的变化有时一致(正相关，如3号猪)，有时不一致(负相关，如2号猪)。ephrinA1基因的表达量峰值和大多数繁殖性状的最低值同时出现在1号猪；相反，ephrinA1基因的表达量最低值和大多数繁殖性状的峰值同时出现在6号猪 ，这说明ephrinA1基因mRNA表达与繁殖性状间的相关性在不同猪之间也有差异(图4)。

表3ephrinA1基因mRNA表达与长大母猪繁殖性状间的相关系数

基因胚胎重/g胚胎长/mm总胚胎数正常胚胎数卵巢重/gephrin A10.360.49-0.25-0.230.15

图4ephrinA1基因在每头猪繁殖组织中的mRNA表达与其繁殖性状间的关联分析

3 讨论

猪胚胎在第18天和第24天之间完成胚胎附植[27-28]，胚胎附植中的胚胎数量和尺寸是影响产仔数和初生重要因素[13]。由于产仔性状是伴性性状，故用标记辅助选择技术辅助选择 (marker-assisted selection, MAS) 技术可以更有效地加快育种效率[29-30]。而MAS的应用需要我们挖掘更多的候选基因及其分子标记[31]。因此，本研究旨在确定高胚猪和低胚猪之间是否存在ephrinA1基因的表达变化，以及这些表达变化是否与胚胎性状之间存在某些关联。

高胚猪和低胚猪的制备试验结果显示，黄体数、正常胚胎数和总胚胎数均受PG600剂量的显著影响，相比于1倍剂量，1.5倍的剂量会增加上述性状值，这表明较高的PG600能诱导更多的排卵和更多的胚胎进行附植。55%的母猪在注射PG600后7 d内诱导发情，且这些发情母猪中90%会正常排卵[32]。初情期大白猪母猪用PG600处理后，排卵率会显著提高[33]。ephrin A1在高胚猪胚胎中的mRNA和蛋白表达显著低于低胚猪，表明低ephrin A1表达对胚胎数量具有有利影响，这可能与Eph-ephrin系统的功能有关，有报道表明其在多种哺乳动物的胚胎附植期间细胞迁移和黏附过程中发挥排斥功能[16，34]。

基因表达结果表明妊娠猪ephrin A1的mRNA表达量显著高于空怀猪，且猪早期妊娠的胚胎附植后期，ephrin A1的mRNA在子宫内膜附植点的表达量最高，显著高于子宫内膜附植点间、尿囊绒毛膜、胚胎、子宫颈和卵巢黄体，说明子宫内膜附植点可能是ephrin A1 mRNA表达的靶组织。周艳红等[35]研究表明，ephrinA1基因在梅山猪妊娠第24天有较高表达量，高于妊娠第13天，但低于妊娠第18天；ephrin A1编码区有5个cSNPs变异，其中2个导致氨基酸突变,分别为Glu29Asn和Trp33Arg，位于ephrin A1外显子1和外显子2上[35]。LIM等[16]研究表明，ephrin A1在妊娠第20天猪子宫内膜的mRNA表达量高于妊娠第9、10、12、13天和空怀猪，但低于妊娠第 14天和第30天。有研究表明，胚胎附植期，ephrin A1 mRNA 在人胚泡中有强表达[34]。本研究Western blot结果显示，妊娠第24天，ephrin A1蛋白在子宫内膜附植点的表达量最高，其次为子宫内膜附植点间和卵巢黄体，蛋白表达趋势与mRNA表达趋势一致，且这个表达差异排序与瘦素受体[36]、脂肪肥胖相关基因[23]等基因的表达规律类似。

基因表达与繁殖性状之间的关联结果表明，ephrin A1的mRNA表达与总胚胎数(或正常胚胎数)之间呈负相关，与胚胎长度、重量呈正相关，由此作者推测这些基因的强烈表达可能不利于在附植后期提高胚胎数量，而有利于在此时期改善胚胎发育(长度和重量增加)。 FUJII等[34]报道，ephrin A1可以促进人Ishikawa细胞中的细胞间解离，这表明通过打开子宫内膜上皮细胞屏障在胚胎附植的初始阶段中起重要作用 。ephrin A1的沉默表达会降低猪子宫内膜上皮细胞的迁移和黏附[22]。

综上所述，高/低胚胎数母猪可以由PG600诱导生产，ephrin A1表达可能参与猪胚胎附植后期的基因调控，子宫内膜附着位点可能是ephrin A1表达的靶组织，附植后期ephrin A1 mRNA表达与胚胎长度呈正相关，与胚胎数量呈负相关，这些会进一步影响胚胎发育。