苏鹏涛，杨劝生，赵强，王顺才，汪霞平

（1.金昌市人民医院，甘肃金昌 737100；2.甘肃工业职业技术学院，甘肃天水741025；3.天水师范学院，甘肃天水741001；4.甘肃天水岐黄药业有限责任公司，甘肃天水 741018）

红茂草富含挥发油、生物碱、黄酮等多种成分， 味苦、涩，性凉，有清热解毒、抗菌消炎、消肿止痛等功效[1-2]。用于治疗动物各类创伤性炎症和开放性淋巴结核、羊传染性脓疱病、家兔皮肤毛囊炎、动物皮肤疥癣病等症。本研究采用代谢组学方法，考察红茂草挥发油足肿胀大鼠血浆内源性代谢物的变化，为该药物的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS），美国Aglient公司；CPA225D型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；涡旋振荡器，德国IKA公司；5920R型冷冻告诉离心机，德国Eddendorf公司；KMD型调温电热套，山东永兴仪器厂；迷你匀质机，加拿大ATS公司；挥发油提取装置，天津市天玻玻璃仪器有限公司。

乙腈、甲醇，色谱纯，Baker公司；甲酸，分析纯，Signia公司；地塞米松磷酸钠注射液（Dex），2 mg/mL，批号1901403，山西晋新双鹤药业有限责任公司；叉菜胶I型，25 g，批号C1013，Sigma公司产品，临用前用新鲜的生理盐水配制。

1.2 试验材料及预处理

Wistar大鼠，购于甘肃中医药大学实验动物中心，取体重200 g±20 g健康大鼠置于光照和黑暗环境（温度22 ℃±5 ℃、湿度50%±5%）下饲养；红茂草挥发油，采用CO2超临界萃取法制备[3]。

1.3 试验方法

1.3.1 动物分组

80只Wistar大鼠每天自由饮食饮水各12 h，适应7 d，随机分为空白对照（C）、阴性对照（NC）、给药试验（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）、地塞米松阳性对照（Dex）8组，每组10只，均在左后足踝关节处标记。

1.3.2 造模

空白对照和阴性对照：每日1次灌胃生理盐水（2.0 mL/kg），正常饲养，连续灌胃7 d；给药试验：每日1次分别灌胃红毛草挥发油（2.0 mL/kg、1.5 mL/kg、1.0 mL/kg、0.5 mL/kg、0.2 mL/kg）7 d，饲养同上；地塞米松阳性对照：同空白对照组灌胃及饲养6 d，第7 d时腹腔注射地塞米松（40 μg/kg）。所有大鼠在第7 d给药后30 min，在右后足跖部皮下注射1%角叉菜胶溶液 0.1 mL 造模[4]。

1.3.3 血浆采集与预处理

用10%的水合氯醛溶液麻醉致炎8 h后的大鼠，采集后右足动脉血，置于盛有EDTA-K2试管中，在40 ℃条件下离心（3 000 r/min）10 min，上清液涡旋震荡 5 s，取 100 μL 血浆样品 8 份，分别加入 300 μL甲醇涡旋震荡30 s，4 ℃条件静置及离心，上清液于4 ℃存储。

1.3.4 色谱条件

C18色谱柱 Phnomenx（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相组成：A为水-0.1%甲酸，B为乙腈-0.1%甲酸；柱温 40 ℃，进样器温度 4 ℃，流速 0.8 mL/min，进样量 10 μL。

1.3.5 数据分析

利用自动进样系统采集数据、提取对齐UPLC-Q/TOF-MS原始数据，通过XCMS软件进行峰提取、去噪、匹配、对齐以及数据的导出和保存。经归一化处理和修正的Excel文件导入SIMCA-P 11.5和SPSS 22.0软件，结合偏最小二乘法选出P＜0.05的生物性标志物。

1.3.6 鉴定差异代谢物

根据保留时间（tR）和变量重要因子（VIP）质谱信息结合京都基因与基因组百科全书（KEGG）等数据库检索，分辨代谢物MS谱，确定差异代谢物及含量变化。

2 结果与分析

2.1 不同剂量红茂草挥发油对大鼠足肿胀的影响

分别造模后于 1 h、2 h、3 h、5 h 和 8 h 测定致肿胀的足容积，计算各大鼠致右后足跖肿胀前后容积变化值，以足肿胀度和足肿胀抑制百分率表示药物的抗炎效果，结果如表1所示。结果表明，与对照组比较，给药试验组组均有显著的抑制大鼠角叉菜胶性足肿胀的作用（P＜0.05）。

2.2 差异代谢产物

2.2.1 建立血浆样本代谢物分析多变量数据

采用UPLC-Q/TOF-MS对血浆样本分析红毛草挥发油干预角叉菜胶致大鼠足肿胀的效果，在正负离子模式下分析见图1和图2。可以看出在正负离子模式下，8组血浆样本中空白组、阴性对照组、试验组及地塞米松阳性组相互分离明显，试验组中红茂草挥发油剂量的增加呈现向空白组和地塞米松阳性对照组靠近的趋势，说明给予不同量的红茂草挥发油，均对炎症大鼠异常的生理及物质代谢有明显的调节作用，且剂量越大效果越明显。

表1 各组大鼠不同时点抗角叉菜胶所致足肿胀度比较

图1 正离子模式下8组大鼠的血浆分析结果

图2 负离子模式下8组大鼠的血浆分析结果

2.2.2 鉴定差异代谢产物

根据保留时间（tR）和变量重要因子（VIP）质谱信息，通过筛选、查询，并与京都基因与基因组百科全书（KEGG）等数据库比较，鉴定出在正负离子模式下血浆样品中12个潜在的差异代谢物，结果见表2所示。

表2 血浆中差异代谢物序号

可见，血浆样品中分离出12个潜在的差异代谢物，与空白对照组比较，正离子模式下阴性对照组大鼠血浆中芳樟醇、小茴香醇、3,5-二乙基甲苯、香叶醇、橙花醇和3,5-二乙基甲苯含量明显高于空白组（P＜0.05）；负离子模式下阴性对照组大鼠血浆中1,3-二甲基萘、1-十六碳烯-1-醇乙酸乙酯、3,4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛、壬酸、2-乙烯基萘和肉桂醛含量明显低于空白组（P＜0.05）。试验组中的这些标志物含量均向空白组和地塞米松阳性对照组回归，说明给予不同量的红茂草挥发油均对角叉菜胶致足炎症大鼠异常的生理及物质代谢有明显的调节作用。

3 结论

通过代谢组学方法研究红茂草挥发油抗大鼠足肿胀炎症作用机制，显示不同剂量的红茂草挥发油均可抑制大鼠角叉菜胶性足肿胀，调节炎症大鼠异常的生理及物质代谢，剂量越大作用效果越明显。以血浆样本分析寻找出内源性代谢产物，比较药物作用于模型大鼠靶器官或组织前后内源性小分子代谢物（数量、种类）的变化，筛选比对鉴定出12种差异代谢物。研究表明，红茂草挥发油主要是通过调节血浆物质的代谢发挥抗炎作用，揭示药物与机体间的相互作用机制，为新药研发提供参考。