尹子叶，张圆媛，李颖，刘婧涵，高月滢，刘琳，皮付伟

（江南大学，江苏无锡 214000）

随着纳米技术的飞速发展，复杂三维结构的多枝状金纳米粒子已成为一种新型纳米材料[1]。多枝状金纳米粒子具有独特的物理化学性质如光学特性、生物亲和性和较大的比表面积等[2]，其制备及应用方面的研究已成为材料领域研究的前沿课题。多枝状金纳米颗粒安全性高、稳定性好、易于制备且具有独特的电学效应、光学效应和磁学效应[3]，因此，在生物医学领域具有极高的应用价值。国内外制备多枝状金纳米材料的方法主要包括两种，分别是种子介导生长法和一步合成法。其中，种子介导生长法是目前运用最为普遍的方法，具有很好的可控性，但周期较长、操作复杂，吸附在材料表面的表面活性剂难以去除，容易对后续的应用造成影响。因此，通过实验改良了种子介导生长法的缺点，极大地缩短其周期，在10 s内合成了无表面活性剂吸附的多枝状金纳米颗粒，命名为MSGNS。最新研究发现Anti-GPC3与金纳米材料的结合能增强材料对HepG2细胞的递送，这种以抗体搭建纳米材料载体靶向癌症细胞的研究思路，已被证实具有很好的实际应用性[4]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

氯金酸（HAuCl4，纯度≥99%）、盐酸（HCl）等无机试剂购自国药控股化学试剂有限公司（中国上海）。PBS缓冲液和胰蛋白酶等购自碧云天生物技术有限公司（中国上海）。DMEM基础试剂购自Thermo Fisher Scientific（美国）。Anti-Glypican 3 抗体 [9C2]购自Abcam（英国剑桥）。

VB-40立式高温高压灭菌锅，德国SYSTEC；激光共聚焦显微镜，德国徕卡仪器有限公司；Avaspec 2048紫外-可见分光光度计，荷兰；JEM-2100透射式电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；THZ-D台式恒温振荡器，上海百典仪器设备有限公司；EX-OHOUS电子天平，美国奥豪斯公司；Eppendorf离心机，德国艾本德公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MSGNS的合成

采用改进的Turkevich方法制备MSGNS。金种子液：搅拌条件下将 100 mL 的 0.75 mmol/L HAuCl4溶液在水浴下回流，之后添加2.19 mL的155.2 mmol/L柠檬酸三钠溶液。待溶液变为深红色后，继续回流15 min，在4 ℃保存。在室温25 ℃剧烈搅拌下将80 μL AgNO3（10 mmol/L）和200 μL抗坏血酸（0.1 mol/L），同时添加到含有 19.208 mL 超纯水、0.4 mL HAuCl4（25 mmol/L）、40 μL HCl（1 mol/L）和 72 μL 金种子液的混合溶液中，10 s后溶液颜色由粉红色变为蓝色。

1.2.2 MSGNS-GPC3的构建

将 2 mL 制备好的纳米溶液与 6 mL Bicine 缓冲液混合，以 1 300 r/min 的速度搅拌，然后加入 20 mg固体粉末状巯基聚乙二醇（Mercapto polyethylene glycol，SH-PEG），在25 ℃下以1 000 r/min的速度搅拌36 h。超纯水离心洗涤 3 次（6 000 r/min，5 min），4 ℃保存。用蒸馏水将 Anti-GPC3（1 mg/mL）稀释100倍，将其与MSGNS以1∶20体积比混合4 ℃孵育 12 h。8 000 r/min 离心 10 min，倒出上清液，原始浓度稀释沉淀物得到MSGNS-GPC3。

1.2.3 细胞培养

将冻存的细胞在37 ℃水浴条件下溶解，800 r/min离心5 min去掉冻存液，用5 mL完全培养基（胎牛血清FBS、Dulbecco改良的Eagle培养基DMEM体积比1∶9）重悬细胞，将相同浓度（100 μg/mL）的MSGNS-GPC3和MSGNS分别与HepG2细胞在37 ℃恒温培养箱中共同培养。

2 结果和讨论

2.1 合成多枝状金纳米颗粒过程中不同时间点的表征

将合成MSGNS过程中出现在3个不同时间点（5 s、7 s、10 s）的溶液进行 TEM 和紫外测试，加入Vc和硝酸银的时间点为0 s。如图1和表1所示，5 s的溶液呈粉红色且此时金纳米颗粒呈球形，在580 nm处出现一个特征峰；7 s的溶液变成浅蓝色，颗粒呈有触角的球形，特征吸收峰迁移到1 030 nm；10 s时得到MSGNS溶液为深蓝色，TEM清晰显示多枝状金纳米颗粒的分枝。根据经典的Turkevich方法的机理，结合文献[5]中观察到的种子介导的金纳米球向金纳米六角形星的生长过程，可以得出结论，合成的MSGNS是通过Au原子各向异性而使得Au逐渐沉积在添加的种子上而合成。

图1 合成多枝状金纳米颗粒过程中不同时间点的表征

2.2 金纳米颗粒在不同状态下的粒径和分散度

MSGNS和改性后MSGNS的直径大小（DIA）和分散性（PDI）见表1。如表1所示，MSGNS-GPC3的平均粒径为（277.67±2.36）nm，远大于MSGNSPEG的（212.68±2.61）nm和 MSGNS的（188.82±3.26）nm，PDI值均小于0.2，结果表明MSGNSGPC3构建成功且分散性良好。

表1 金纳米颗粒在不同状态下的粒径和分散度

2.3 MSGNS-GPC3和MSGNS分别与HepG2细胞共同培养

将MSGNS-GPC3和MSGNS-PEG分别与HepG2细胞共同培养，如图3所示。两组细胞在0.5 h内没有显著差异。4 h后，少量MSGNS-PEG通过内吞作用存在于细胞体内，12 h后则大量聚集在细胞内部。相反，MSGNS-GPC3即使培养时间长达12 h，也不发生胞吞和聚集，而是被吸附在细胞膜上。结果表明，多枝状金纳米颗粒-GPC3可以在HepG2细胞膜上长时间共存。

图3 MSGNS-PEG（d、e、f）和 MSGNS-GPC3（a、b、c）分别与HepG2细胞共培养的时间分辨光学图

3 结论

本文合成了多枝状金纳米颗粒并分析其合成机理，将其与Anti-GPC3偶联后发现其可以被吸附在HepG2细胞膜表面上且长时间与细胞共存。研究提供了合成多枝状金纳米材料的新方法，相比以前的方法其效率更高且不形成表面活性剂，有利于多枝状金纳米颗粒后续的修饰与应用，同时其细胞界面上的吸附性在癌细胞的诊疗方面具有很好的应用潜力。