王红艳，杨 月，刘 野，刘金丽，郭素芬

(1.牡丹江医学院病理教研室;2.牡丹江市第二人民医院病理科，黑龙江 牡丹江 157011)

乳腺癌是全球女性恶性肿瘤中之常见肿瘤，对女性的身心健康危害极大，也是当今医疗卫生部门关注的重要课题。因此，研究探讨在乳腺癌的发生、发展过程中起到关键作用的因素尤为重要。Nanog 是一个重要的干细胞标记物，作为一种可以维持胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)多能性以及自我更新时所需的核心转录因子而言，其功能较为强大。在体内，随着细胞分化程度的改变，Nanog的表达呈逐渐降低趋势[1]，当细胞完全分化时则不表达[2]。经以往的研究表明Nanog在膀胱尿路上皮癌、肝细胞癌及乳腺癌等[3-5]多种人类实体肿瘤中的表达均有增加，且与肿瘤的发生、发展及耐药和转移等密切相关[6]。肿瘤的生长有赖于血液供应[7]，丰富的新生血管可以为肿瘤细胞提供充足的营养成分，有助于肿瘤细胞的分化、增殖以及侵袭。肿瘤微血管密度(microvessel density，MVD)是在肿瘤特定区域内对微血管进行计数，用以来观察肿瘤血管的生成情况。大量研究表明，肿瘤患者MVD与多种肿瘤生长进程及预后密切相关[8-9]，是一个重要的病变反应参数。本实验应用血管内皮细胞标记物CD34的着染情况，来对肿瘤微血管进行计数，从而分析MVD在各级别乳腺IDC-NST中的分布趋势，并探讨Nanog与MVD之间的关系，以及Nanog和MVD与临床病理参数的相关性，从而进一步为乳腺癌的诊疗及判断预后提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集不同级别乳腺IDC-NST患者石蜡标本40例，癌旁正常乳腺石蜡标本20例(距癌组织边缘5cm以上)，癌旁乳腺组织经病理学证实无癌细胞存留，方可选取应用，所有标本在制成蜡块前，必须及时经福尔马林成分固定。所选病例患者均为女性，术前均未进行任何放、化疗及内分泌治疗等，术后经过病理学证实，并有完整可用的临床资料。入选标本均收集于牡丹江医学院附属红旗医院病理诊断中心和牡丹江市第二人民医院病理科2017年10月至2019年6月间的石蜡标本。

1.2 方法本实验IHC采用多聚体两步法(EnVision法)。一抗Nanog 抗体为浓缩液(配置1∶400工作液)，CD34抗体为即用型工作液；修复液分别选用柠檬酸盐(PH6.0)和EDTA(PH9.0)；抗原修复法选用微波修复；Nanog需要4℃过夜，CD34室温孵育1h；DAB显色结束后，显微镜下观察分析结果。一抗试剂分别购自北京博奥森生物科技有限公司、广州安必平科技有限公司，二抗试剂(包含DAB显色液)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 结果判定

1.3.1 Nanog阳性判定标准 Nanog阳性模式为细胞核着色，染成棕黄色。结果判读标准参见半定量免疫反应评分法(immunoreactivity score，IRS)判定[10]，此法根据阳性细胞数在观察细胞总数中所占的百分比(percent of positive,PP)以及着色强度(staining intensity,SI)的乘积进行评分。本实验Nanog蛋白染色判读标准参见表1。

表1 Nanog蛋白免疫组化读片判断标准

1.3.2 CD34抗体阳性判定标准 CD34抗体阳性模式为血管内皮细胞膜着色，染成棕黄色。MVD计数方法[11]：(1)通过低倍镜(×100)扫视切片，寻找出肿瘤中新生血管形成程度最高的“热点”区域，此区域最常出现在癌的边缘；(2)计数5个高倍(×400)视野内的微血管数量，并计算其平均值，即MVD。纳入MVD计数的标准主要有以下几点：(1)着染成黄褐色的内皮细胞或内皮细胞簇；(2)被染血管须与肿瘤背景成分有较为明显的差别；(3)紧邻良性乳腺组织的微血管不在判定范围；(4)厚壁血管不纳入计数范畴；(5)硬化区血管也不包括。

1.4 统计学方法采用 SPSS 20.0统计学软件进行处理，计量数据采用“均数±标准差”表示，组间比较采用t检验或方差分析，组间率的比较采用卡方检验，Fisher确切概率法，相关系数分析使用Spearman秩相关系数表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nanog蛋白在乳腺IDC-NST中的表达IHC结果显示：Nanog蛋白在乳腺IDC-NST组织标本中表达明显(图1A)，而在癌旁正常乳腺组织标本中确未见表达(图1B)，且二者差异明显，具有统计学意义(P<0.001，表2)。Nanog蛋白在各级别乳腺IDC-NST的表达中发现，在组织学分级III级中，无论是阳性细胞数量，还是Nanog蛋白表达强度与I、II级乳腺癌相比均有增加(图2A～C，表3)。

图1 Nanog蛋白在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达

注：A：Nanog蛋白在乳腺IDC-NST的阳性表达中(×200)；B：乳腺癌旁正常组织中Nanog阴性表达(×200)

表2 Nanog蛋白在乳腺IDC-NST与癌旁正常组织中的表达

图2 Nanog在各级别乳腺IDC-NST组织学中的表达(×200)

表3 Nanog蛋白在乳腺IDC-NST组织学分级中的差异表达

组织学分级例数Nanog(-)(+)(++)(+++)ZPI～II级248385III级1611311-2.9220.004

2.2 Nanog蛋白在乳腺IDC-NST中的表达与临床病理参数的相关性通过与临床相关病理参数的统计分析发现，Nanog蛋白的表达与乳腺癌病理组织学分级、TNM分期以及淋巴结转移情况相关，而与被检标本者年龄、月经情况及肿瘤大小无关(表4)。

表4 Nanog在乳腺IDC-NST中的表达与临床病理参数的相关性

注：#表示使用连续性矫正，*表示使用Fisher确切概率

2.3 乳腺IDC-NST中MVD及其与临床病理参数的相关性应用IHC方法选用CD34抗体对微血管进行染色，通过着染结果分析显示，MVD在乳腺IDC-NST组织学III级中的密度与I、II级相比明显增多(图3A～C)，差异显著(F=22.184，P<0.001，表5)，进一步两两比较不同分级间的MVD，其差异均有统计学意义(图4)。MVD与被检样本年龄无关，与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期关系密切，差异具有统计学意义(表6)。

图3 乳腺IDC-NST各级别组织学分级中MVD分布(×400)

图4 乳腺IDC-NST各级别组织学分级中MVD分布结果

表6 乳腺IDC-NST中MVD计数值与临床相关病理参数的关系

病理病理参数例数MVD计数tP年龄 <501729.25±10.73-1.0840.285 ≥502332.54±8.50淋巴结转移情况 有2435.28±9.52-3.1410.003 无1626.38±7.50肿瘤大小 ≤2cm1727.12±8.85-2.4390.020 >2cm2334.11±9.06TNM分期 I～II期3028.49±8.15-3.4430.001 III～IV期1039.08±9.23

2.4 乳腺IDC-NST中MVD与Nanog相关性本实验中我们发现在乳腺IDC-NST中Nanog阳性表达组MVD计数明显高于Nanog阴性组，经Spearman相关性统计分析显示Nanog与MVD具有显著相关性，呈正相关(表7)。

表7 乳腺IDC-NST中Nanog与MVD相关性

3 讨论

Nanog 最初由Chambers等[12]在小鼠ESCs中被发现，随着研究的不断深入，Nanog在ESCs自我更新和多能性方面具有的重要作用逐步被揭示，于是对Nanog的研究便纷纷增加。在既往研究中发现Nanog可以在胚胎发育早期及ESCs中表达，也可以表达在肿瘤组织中，但是在分化成熟的组织细胞中则恒定不表达。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSCs)和ESCs具有共同表现型特征，这种特征表现在两种细胞都生长迅速，以及二者的端粒酶均呈高表达方面，这都说明Nanog可以作为重要的干细胞标志物被检测研究。在多项研究中也逐渐被证实，Nanog可在多种恶性实体瘤中有不同程度的表达，其表达高低与肿瘤的发展进程以及预后关系密切。有研究证明Nanog和Oct4、Sox2具有相似的作用，是乳腺癌干细胞重要的转录因子和生物标志物[13]，通过下调Nanog可以抑制乳腺癌干细胞的增殖[14]，并且Nanog的表达与肿瘤细胞分化程度密切相关。Watanabe等[15]在对60例口腔鳞状细胞癌临床相关性研究中发现Nanog表达的高低与肿瘤细胞分化程度、转移以及对新辅助化疗的抵抗关系密切。Thiagarajan等[16]研究发现Cx26、Nanog、FAK在三阴性乳腺癌干细胞中以三元复合物的形式存在，该复合物在CSCs自我更新中发挥不可缺少的重要作用。本实验结果Nanog在不同级别乳腺浸润性导管癌中的表达随着病理分级增高而增加，并与淋巴结转移、TNM分期关系密切，这说明Nanog在乳腺癌的发生、发展中具有重要作用。

众所周知，肿瘤生长与血管的形成密切相关，而肿瘤血管的生成受多因子、多细胞、多环境因素相互调控共同影响[17]。CSCs不仅具有强大的自我更新能力及多向分化潜能，还可通过多条信号通路诱导、促进肿瘤血管形成，为其生长提供能源。一般情况下在血管形成前期，没有血管供应，肿瘤不能生长超过2mm[18]，此时，其营养主要依赖于周围组织细胞，肿瘤的侵袭力较差、极少发生转移[17]，而当肿瘤组织最大径大于2mm时，则需要依赖于血管供氧及营养物质，肿瘤的生长速度不仅加快，其侵袭力、转移性也随之增强。有文献提及MVD是浸润性乳腺癌的一个预后因素[19]，Guo等[20]研究也发现，乳腺癌中MVD与淋巴结转移、TNM分期呈正相关，这进一步证明了MVD在乳腺癌中对判断预后具有的重要性。本实验中，鉴于肿瘤生长与血管的形成密切相关，于是我们利用CD34对不同级别的乳腺癌组织进行染色观察MVD，结果发现在乳腺IDC-NST病理组织学III级中MVD明显高于I、II级，这说明血管的形成在肿瘤生长中的重要性，以及观察MVD对乳腺癌预后判断具有的重要意义；而且本实验还进一步证明Nanog与MVD在乳腺癌浸润性导管癌中的表达呈正相关，这也可推测维持干细胞特性的Nanog表达可能与肿瘤新生血管形成有关，需进一步研究。

综上所述，Nanog与MVD联合检测有望成为乳腺癌新诊疗靶点及判断预后的指标。