安 琪，徐富刚，刘 勇，高凤敏

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

心肌损伤是多种心血管疾病如高血压、冠心病、心力衰竭等的共同病理改变，包括心肌细胞丢失、心肌细胞肥大及间质胶原含量的增加[1]。内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)是细胞对外界刺激的应激响应机制，与心血管疾病的发生发展密不可分。研究显示，抑制ERS的发生可以有效保护心肌，是预防和治疗心血管疾病的主要靶点之一[2-3]。丹参(Salvia)是我国的传统中药，常用于心血管疾病的治疗[4-5]。尽管丹参的有效成分在心肌梗死和心肌缺血再灌注损伤方面显示出良好的治疗潜力，但在心肌肥厚和心肌纤维化的药理作用的研究仍然有限[6]。本研究应用异丙肾上腺素诱导小鼠心肌损伤，并给与不同剂量丹参进行治疗，观察丹参对心肌损伤的保护机制是否与抑制内质网应激有关。

1 材料与方法

1.1 主要药物及试剂异丙肾上腺素、苏木素、Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)；注射用丹参(哈药集团中药二厂)；伊红(安徽雷根生物技术有限司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；彩色预染蛋白质分子量标准(Thermo Scientific公司)；RNA提取试剂盒(OMEGA有限公司)；逆转录试剂盒、SYBR Green(罗氏制药有限公司)；引物(生工生物工程上海股份有限公司)；Anti-β-Actin抗体、Anti-Caspase-12抗体、Anti-Cleaved Caspase-3抗体、HRP标记山羊抗兔IgG(abcam公司)；Anti-GRP94抗体、Anti-IRE1抗体、Anti-p-JNK抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 主要仪器脱水机、包埋机、切片机(德国莱卡公司)；电泳仪、转膜仪(BIO-RAD公司)；酶标仪(Molecular Devices公司)；化学发光成像系统(GE公司)；低温高速离心机(Eppeadorf公司)；恒温水浴锅(上海蓝伊科学仪器厂)；超微量核酸蛋白测定仪(Thermo FisherScientific公司)；实时荧光定量PCR仪(ABI公司)。

1.3 实验动物小鼠32只，品系ICR(Institute of Cancer Research)，雄性，8周龄，清洁级，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号SCXK(辽)2015-0001，批次NO.21100230052293，体质量平均(22±1)g。饲养环境：牡丹江医学院医药研究中心，室温22℃，湿度60%。动物实验设施使用许可：SYXK(黑)2019-006。本实验通过牡丹江医学院动物福利和伦理管理委员会批准。

1.4 模型建立小鼠适应性饲养2周，适应结束后留取8只作为对照组(Con)，其余24只腹腔注射异丙肾上腺素诱导心肌损伤，剂量2mg/(kg·d)，对照组注射同等剂量生理盐水，连续2周。

1.5 分组及给药将造模小鼠随机分为三组，即模型组(ISO)、丹参低剂量治疗组(SL)和丹参高剂量治疗组(SH)，每组8只，早上继续注射ISO，对照组给与生理盐水；晚上治疗组腹腔注射丹参，低剂量组40mg/(kg·d)，高剂量组80mg/(kg·d)，对照组和模型组组给与同等剂量生理盐水，连续2周。

1.6 心脏质量、心脏质量指数测定实验4周末记录体质量。采用断颈法处死小鼠，取出心脏，称取心脏质量。心脏质量指数(mg/g)=心脏质量/体质量。

1.7 心脏组织病理学检查取小鼠左心室心肌组织于4%多聚甲醛固定，制作病理切片，进行HE和MASSON染色，光学显微镜观察病理改变。

1.8 Western Blot检测心肌组织GRP94、IRE1、p-JNK、Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白水平取冻存心肌组织约20mg提取总蛋白；BCA法测定蛋白浓度；SDS-PAGE凝胶电泳；转膜；5g脱脂奶粉加入100mL的TBST封闭，室温下振荡2h；加入一抗(稀释比例1∶1000)，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次；加入二抗溶液(稀释比例1∶5000)，室温下震荡孵育1h；TBST洗膜；滴加ECL发光试剂，曝光，对照片进行灰度值分析。

1.9 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测心肌组织GRP94、IRE1、JNK、Caspase-12、Caspase-3 mRNA表达按照说明书提取心肌组织总RNA，用超微量核酸蛋白测定仪测定RNA浓度。将RNA反转录为cDNA，然后进行Real-time PCR。反应体系20μL：SYBR Green Mix10μL，cDNA2μL，检测基因上下游引物各1μL，去离子水6μL。反应条件95°C预变性5min，95°C变性30S，60°C退火30S，72°C延伸40S，循环30次。实验结果通过2-△△Ct法进行统计分析。

表1 引物序列

1.10 统计学分析采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，统计结果用“均数±标准差”表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 一般指标变化情况ISO组小鼠较对照组活动量减少，出现腹式呼吸；丹参治疗组一般情况良好。ISO组心脏质量、心脏质量指数较对照组增高(P<0.05)，SH治疗组心脏质量、心脏质量指数较模型组降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠一般指标变化

注：与Con组比较，*P<0.05；与ISO组比较，#P<0.05

2.2 心肌组织病理学变化HE染色显示，Con组小鼠细胞形态和结构正常，细胞核、细胞质染色均匀，结构清晰，心肌纤维排列整齐、规则。而ISO组小鼠心肌细胞肥大、结构紊乱，细胞核不规则；心肌纤维肿胀、疏松，排列紊乱，可见断裂与空泡样变性。与ISO组相比，丹参治疗组心肌纤维排列相对规整，肌纤维断裂和空泡减少，且高剂量干预效果优于低剂量。MASSON染色结果显示，相较Con组，ISO组小鼠心肌组织胶原纤维明显增多，纤维化程度增强。治疗组心肌组织胶原纤维减少，纤维化程度减轻，且高剂量治疗效果明显。见图1。

图1 各组小鼠心肌组织HE和MASSON染色(×200)

2.3 Western Blot结果ISO组小鼠心肌组织GRP94、IRE1、p-JNK、Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表达较对照组显著升高(P<0.001)；SL组蛋白表达明显降低(P<0.001)；与SL组比较，SH组对GRP94(0.76±0.05)vs(0.89±0.04)(P<0.05)、p-JNK(1.83±0.09)vs(2.20±0.15)(P<0.01)、Caspase-12(0.78±0.08)vs(1.15±0.14)(P<0.001)、Cleaved Caspase-3(0.91±0.05)vs(1.15±0.10)(P<0.001)的干预效果更加明显。见图2。

2.4 Real-Time PCR结果ISO组小鼠心肌组织GRP94、IRE1、JNK、Caspase-12、Caspase-3 mRNA表达较对照组显著升高(P<0.001)；SL组表达明显降低；与SL组比较，SH对GRP94(2.03±0.13)vs(2.97±0.08)(P<0.001)、IRE1(1.80±0.32)vs(2.74±0.69)(P<0.05)、JNK(1.62±0.14)vs(2.94±0.27)(P<0.001)、Caspase-12(2.10±0.71)vs(3.11±0.34)(P<0.001)的干预效果更加显著。见图3。

图3 各组小鼠心肌组织GRP94、IRE1、JNK、Caspase-12、Cleaved Caspase-3 mRNA表达

注：与Con组比较，***P<0.001;与ISO组比较，##P<0.01，###P<0.001

3 讨论

内质网应激是细胞受到应激刺激导致内质网稳态破坏，未折叠和错误折叠蛋白质在内质网腔异常蓄积的现象。为了对抗应激带来的破坏作用，内质网启动未折叠蛋白反应促进细胞保护性适应，维持细胞存活[7]。内质网分子伴侣的表达增加是ERS的早期适应性反应，也是反映应激严重程度的指标。GRP94是一种钙结合蛋白，ERS发生后，内质网上调GRP94的表达，抑制蛋白质合成，促进错误折叠蛋白和未折叠蛋白的降解，从而缓解ERS[8]。若应激持续或严重，则启动凋亡相关因子和通路，引起细胞凋亡。内质网跨膜蛋白肌醇需求酶1(IRE1)通过腔内压力感受结构域感知内环境变化，其下游有两条信号通路，IRE1-XBP1和IRE1-JNK信号通路，分别介导未折叠蛋白反应和细胞凋亡，是决定细胞存亡的关键因素[9]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族主要成分之一，在应激刺激下激活，JNK的苏氨酸和酪氨酸位点发生磷酸化，JNK转移至细胞核，调节转录因子活性。磷酸化的p-JNK一方面激活促凋亡因子BAX，另一方面抑制抗凋亡因子BCL-2，从而诱导细胞凋亡。此外，磷酸化JNK作用于线粒体，导致细胞色素C大量释放，后者与Caspase-9结合，并最终作用于Caspase-3，活化的Caspase-3与下游凋亡底物结合，最终诱发细胞凋亡[10]。Caspase是一组内源性蛋白酶，在细胞凋亡信号转导中处于中心地位。ERS状态下活化的Caspase-12由内质网膜进入细胞质，切割Caspase-9酶原使其活化，Caspase-9顺序激活下游的Caspase-3。Caspase-3水解脱氧核糖核酸酶抑制物、细胞核及细胞质骨架成分，导致DNA降解、细胞核浓缩、核膜分解及凋亡小体的产生，最终导致细胞凋亡[11]。Cleaved Caspase-3是Caspase-3的活化形式，其活性可以有效评估凋亡发生的程度。本研究中模型组GRP94、IRE1、p-JNK、Caspase-12、Cleaved Caspase-3表达明显增加，说明心肌损伤中发生了内质网应激，并启动了凋亡信号通路。

丹参又名赤参，是唇形科草本植物丹参根茎的干根，属活血化瘀药材，其有效成分分为脂溶性和水溶性，具有保护心肌细胞、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成、抗缺氧、抗心律失常等作用[12]。本研究显示，丹参能够改善心肌损伤小鼠的一般情况，降低心脏质量和HW/BW指数，减轻心肌细胞肥大和纤维化。为进一步探究丹参的心肌保护机制，我们测定了内质网应激相关因子。结果显示丹参能明显降低GRP94的表达水平，与宝云龙等的研究一致，后者证实丹参酮ⅡA磺酸钠能降低阿霉素诱导心肌病大鼠心肌细胞GRP94 mRNA表达水平，抑制内质网应激和心肌细胞凋亡[13]。与本研究不同，Xu等应用强心1方(丹参占配伍的1/8)干预脓毒症大鼠心功能不全，结果显示GRP78和CHOP显著降低，但GRP94不受影响[14]。关于丹参对GRP94的影响文献较少，有待研究进一步验证。既往研究证实，IRE1抑制剂可显著降低动脉粥样硬化斑块的大小；替米沙坦和奥美沙坦可降低p-JNK表达，减轻细胞凋亡和心肌肥厚；JNK抑制剂SP600125具有保护心肌细胞的作用；银杏内酯K可以选择性激活IRE1α/XBP1通路、抑制JNK激活[15-17]。本研究中，丹参能显著降低IRE1和p-JNK表达，提示丹参能够减低JNK的磷酸化水平，抑制IRE1下游的凋亡信号通路，减轻心肌损伤。既往研究显示丹参有效成分在缺血再灌注损伤、心脏毒性、肿瘤等方向对凋亡蛋白酶具有干预作用[18-20]，本研究证实丹参能明显降低Caspase-12、Cleaved Caspase-3表达，说明丹参通过抑制Caspase级联反应抑制内质网应激，起到保护心肌作用。

综上所述，内质网应激参与了异丙肾上腺素诱导的心肌损伤，丹参具有保护心肌的作用，其机制与抑制内质网分子伴侣GRP94，凋亡相关信号分子IRE1、JNK、Caspase-12、Caspase-3的抑制有关，且高剂量效果明显。