闫翠香， 邵小明

(1.浙江农林大学暨阳学院， 浙江 诸暨 311800；2.生物多样性与有机农业北京市重点实验室，中国农业大学资源与环境学院， 北京 100193)

掌叶覆盆子(RubuschingiiHu)属蔷薇科悬钩子属植物，为多年生落叶小灌木，即《中国药典》收录的“覆盆子”[1]，主要分布在江西、浙江、江苏、安徽、福建和广西等省。掌叶覆盆子作为重要的药食两用植物资源[1-9]，目前其成熟和未成熟的果实主要靠采摘野生植物资源为主。随全球市场对覆盆子资源需求增长，野生覆盆子资源被破坏性的、无限制的采集利用，致使该野生植物资源生态破坏严重。由于掌叶覆盆子种子休眠的特性[10]，其野外种群的更新由根蘖繁殖完成，实生苗罕见，种子繁殖力低下，目前掌叶覆盆子人工种植的苗木来源主要靠采挖野生苗为主，且根插和分蘖获得苗木的方式，效率低，操作复杂，限制了掌叶覆盆子苗木生产的发展，因此，高效的人工栽培繁殖体系及基地亟待建立。

迄今为止, 国内外有关覆盆子的繁殖、栽培的资料主要为营养繁殖方面[11-13]。以种子繁殖的方式进行人工栽培繁殖技术方面的探索，既可以不破坏现有资源并加以保护，又可以扩大该植物种群数量，发展和壮大种质资源。植物的种子繁殖力受结实特性、采种时间、储藏时间、不同母树等因素的影响。掌叶覆盆子种子深度休眠[14]，酸蚀和赤霉素处理能有效解除休眠，提高发芽率(待发表数据)。种子采集时间[15-17]、储藏时间[18-21]对种子萌发和休眠程度有一定影响，同时，种子萌发受激素平衡调控，例如GA3，ABA，IAA等。因此，对掌叶覆盆子种子繁殖力的影响因素进行研究，可为规范覆盆子良种繁育基地建设、苗圃种子的采集、育苗工作及其人工种植等方面提供理论依据，有助于深入揭示该种子休眠与萌发机制，同时有助于掌叶覆盆子野生资源的保护。

1 研究地点

本研究在江西省德兴市境内进行。德兴蕴藏丰富的中草药资源，素有“出门就是药，山中是药库”的美誉，德兴市 (28°38′～ 29°17′N, 117°23′～113°06′E) 地处赣浙皖交界处的怀玉山脉北麓，气候温暖、光照充足、雨量充沛、四季分明、昼夜温差大、无霜期长，属于典型山区小气候的特点。月均气温较高的是5—10月，均达20 ℃以上，气温最高在7月；冬季气温降低，气温最低是在1月，但仍然在0 ℃以上。全年降雨量为1 869.6 mm，属降雨多的湿润地区，降雨主要集中在4—8月，其中最多是6月；冬季降雨少，最少在11月。适宜中草药生长，据调查，德兴有药用植物1 460余种，道地中药材700多种，占国内植物药材品种的20%以上，掌叶覆盆子是德兴的地理标识产品[22]和特色药材[23]。

2 研究材料与方法

2.1 研究材料

供试种子于2012—2015年采自江西省德兴市覆盆子基地，采集果实后，清洗掉果肉并把种子混匀阴干，待用。

2.2 研究方法

2.2.1结实特性与种子基本特性

成熟果实采集后于室温浸泡在水中，捏碎，用筛子过滤混合物，直至果肉全部洗掉为止，完全清洗的种子在室温下风干5 d，风干后的种子装入信封室温保存 (温度23～25 ℃，湿度20%～50%)。选6株掌叶覆盆子母树，每株随机选20个果实，以每个果实产出饱满种子的粒数表示出种量，对其进行统计分析。

种子的重量分异测定。选6株掌叶覆盆子母树采集成熟果实，每株随机选20个果实，并分离出种子，从每株种子中随机选取4组千粒种子，测量千粒重，研究掌叶覆盆子种子的重量分异。

种子含水量的测定采用105 ℃烘干法，生活力采用TTC(氯化三苯基四氮唑，pH为6.8) 染色法进行[24]。

2.2.2萌发预实验

采用98%硫酸酸蚀0、15、20、25、30 min后，于光照培养箱内[黑暗8 h，(15±1)℃+光照16 h，(25±1)℃]进行萌发实验，结果证明不酸蚀种子无法萌发，且25 min为最佳酸蚀时间(发芽率最高)。在最佳酸蚀时间25 min后，采用GA3+KNO3(34 mg·L-1)浸泡种子24 h，处理结束后马上于光照培养箱内[黑暗8 h，(15±1)℃+光照16 h，(25±1)℃]进行萌发实验，其中GA3设置0、2、20 mg·L-1和200 mg·L-15个梯度。结果证明GA3(2 mg·L-1)+KNO3(34 mg·L-1)发芽率最高。

本实验的种子均进行预处理酸蚀25 min，最后种子置于培养皿中(每皿50粒种子，3个重复)，放置在光照培养箱[黑暗8 h，(15±1)℃+光照16 h，(25±1)℃]进行萌发，当胚根加子叶有一半以上突破种壳，就定义为种子萌发[25]。萌发实验以萌发后连续7 d没有新增种子萌发时结束。

2.2.3采种时间对种子萌发的影响

本研究从4月下旬果实仍为青果时开始采集，至种子成熟后采种结束，设置5个采种时间，分别对应4月24日(青果期)、5月3日(黄绿果期)、5月10日(熟果期)、5月17日(过熟期1)和5月24日(过熟期2)等5个时期，约1周采集1次种子，至少采集6株，每株随机采集20个果实，采集果实后，清洗掉果肉并把种子混匀阴干，采用四分法对种子的千粒重、生活力及萌发率等进行测定。

种子萌发实验处理：酸蚀25 min后激素处理(GA32 mg·L-1+KNO334 mg·L-1)浸泡种子24 h，处理结束马上在光照培养箱内进行萌发实验。

营养土播种实验：将不同采种时间的种子酸蚀25 min后激素处理(GA32 mg·L-1+KNO334 mg·L-1)浸泡种子24 h，处理结束后播种于事先混合好的草炭和蛭石的盆中，每盆播50粒种子，3次重复，种粒间保持一定的距离，覆层薄土，放在光照培养箱内[黑暗8 h，(15±1)℃+光照16 h，(25±1)℃]萌发，3个月后统计出苗率。

2.2.4储藏时间对种子萌发的影响

对掌叶覆盆子种子贮藏时间与其萌发力的关系进行研究。种子采集时间同2.2.3选取。2012年至2015年采集的种子均统一置于室温通风处储藏，于2015年7月份对4年收集的种子统一进行活力测试、有胚率统计和萌发实验。

2.2.5不同母树种子的萌发实验

至少采集6株掌叶覆盆子母树的种子，采集时间同2.2.3。分别测定种子的千粒重、含水量和生活力。进行萌发实验(酸蚀25 min加激素和不加激素处理)。

2.2.6种子内源激素的测定

利用酶联免疫法 (ELISA) 对掌叶覆盆子5个不同采种时间的种子内源ABA、GA3和IAA含量水平进行测定[26]。

2.2.7数据处理和分析

采用最新数据进行处理和分析。发芽率的计算公式如下：发芽率(%)=(n/M)×100%，公式中的n为发芽的种子总数，M为供实验种子数 (50粒)。用SPSS 17.0软件进行数据分析。

3 结果与分析

3.1 结实特性与种子基本特性

结果显示，在所测定的每个聚合果中，出种量137～233粒，平均197.5粒，变异系数为11.9%。从果实的出种量频数图 (图1) 可以看出，种子粒数在225粒以上的果实仅占8.33%，含200～225粒种子的果实比例最大，占全部果实的48.33%，出种量在不同植株个体间的差异并不显著 (显著性0.191，p>0.05)。掌叶覆盆子种子属于小粒种子，采自6株掌叶覆盆子母树的种子千粒重为0.992～1.395 g，平均为1.20 g。采自不同母树种子的重量差异不显著(图2)(显著性0.106，p>0.05)。说明掌叶覆盆子群体内保持着结实特性的一致性，其果实发育的程度基本相同或相近，植株间种子的成熟过程基本一致。

表1 不同采种期对掌叶覆盆子种子萌发的影响

采种日期月-日酸蚀后发芽率(%)清水激素生活力/%千粒重/g土出苗率/%04-240.67±1.15d0.67±1.15e10.67±3.06c0.86±0.09b1.33±2.31c05-0320.00±7.21bc22.00±3.46d63.33±5.03b1.06±0.06a21.33±6.11b05-1031.33±3.06a54.00±2.00a75.33±4.16a1.14±0.10a38.67±10.26a05-1726.67±3.06ab49.33±1.15b76.00±2.00a1.14±0.09a28.67±3.06ab05-2416.00±9.16c33.33±3.06c76.00±5.29a1.15±0.10a18.00±9.16b

注：出苗率为种子酸蚀后，激素浸泡24 h后播种于营养土；方差分析(α= 0.05)，同一列有相同字母表示不同处理间差异不显著 (3个重复)。下同。

掌叶覆盆子当年成熟种子活力测试结果表明，有生活力的种子为75.33%，说明发育良好的种子比例比较高。种子的相对含水量为7.94%。

3.2 采种时间对种子萌发的影响

采种时间显著影响种子发芽率，如表1所示，发芽率和覆土出苗率均先升高后降低，生活力和千粒重先升高后不变， 5月10日(熟果期)采集的种子发芽率、生活力、千粒重及播种出苗率都是最高的，是掌叶覆盆子种子的最佳采集时间。

图1 掌叶覆盆子果实出种量频数分布

图2 掌叶覆盆子种子的重量分异

3.3 采种时间与种子内源激素的变化

如图3所示，种子在逐渐成熟发育阶段(青果期至熟果期)，GA3先降低后升高，ABA先升高后不变，GA3/ABA先降低后升高；熟果期到过熟期5阶段，GA3降低至较低水平，ABA先升高后降低，GA3/ABA降低直至较低水平；果实从青果到过熟的整个采种阶段，IAA和IAA/ABA比值迅速降低并保持不变。

3.4 储藏时间对种子萌发的影响

由表2可以看出，随着储藏年份的增加，种子的活力迅速下降，超过1年的种子，活力已低于10%，储藏3年种子活力为0。酸蚀后清水浸种进行萌发实验，除当年种子能萌发以外，其余均无法萌发。

表2 储藏不同时间种子的活力、胚芽率和萌发情况

采种年份储藏时间/年活力率/%有胚率/%酸蚀后清水培养发芽率/%2015075.33±4.16a76.33±2.08a31.33±3.06a2014111.33±1.15b75.33±3.21a0.00201327.33±1.15b76.00±1.00a0.00201230.00c74.33±0.58a0.00

3.5 不同母树种子的萌发

选取最佳采集时间采集6株掌叶覆盆子的种子，进行了室内萌发实验(表3)，结果表明酸蚀后种子发芽率的变动范围为28.67%～30.67%，平均为29.67%，变异系数为2.36%；酸蚀后的种子经过激素处理后发芽率变动范围为48.67%～52.00%，平均为50.44%，变异系数为2.6%，不同植株种子之间的发芽率差异不显著(p>0.05)。

4 讨 论

4.1 影响掌叶覆盆子种子萌发力的因素

从熟果期到过熟2期，尽管种子的活力和有胚率保持不变，但不管是酸蚀后清水处理还是激素处理，发芽率均迅速下降，说明种子休眠程度加深，有胚率基本不变，很可能是因为种子由浅层生理休眠进入深层生理休眠。因此，采收时间相当重要。

图3 不同采集时期种子内源激素含量变化

表3 掌叶覆盆子不同母树种子发芽实验

母树编号种子粒数发芽率1/%发芽率2/%播种到发芽开始天数/d激素/无激素Z115030.67±3.06a51.33±3.06a6.67±1.15/5.33±0.58Z215029.33±5.03a48.67±4.62a7.33±1.15/5.67±0.58Z315030.00±6.93a49.33±4.16a7.67±0.58/6.00±1.00Z415028.67±4.62a50.00±5.29a8.33±0.58/5.33±0.58Z515029.33±5.03a51.33±4.16a7.67±0.58/6.00±0.00Z615030.00±6.93a52.00±2.00a7.67±0.58/6.00±1.00平均15029.67±0.750.44±1.317.56±0.54/5.72±0.33显著性—0.6880.375—变异系数—2.3602.600—

注：发芽率1为酸蚀种子的发芽率；发芽率2为酸蚀后激素处理的种子发芽率。

常温储藏的掌叶覆盆子种子超过1年以上活力迅速丧失，说明储藏时间较采收时间更为重要，而低温储藏2～10年[27]和22～26年[28]的悬钩子属植物种子取出后进行适当的处理，仍然有部分种子萌发，至于掌叶覆盆子种子是否适合低温储藏，以及低温储藏的条件需要继续研究。

酸蚀是种子萌发的前提条件之一，而适当浓度的GA3可以显著打破种子休眠，大大提高发芽率，可能是因为GA3是影响掌叶覆盆子种子萌发的关键内源激素。通过低温层积改变种子内源激素水平，促进种子萌发，具有显著的效果，对于掌叶覆盆子种子是否有效有待深入研究。

4.2 内源激素水平与种子休眠程度及萌发有着密切的关系

掌叶覆盆子在熟果期种子GA3含量和GA3/ABA比值最高，休眠程度浅，有利于萌发，至过熟1期和2期，种子GA3含量迅速下降，此时ABA维持在较高水平，萌发结果显示休眠程度较之前明显加深。这与GA促进种子萌发、ABA参与调控种子的成熟和抑制种子的过早萌发有关[29]。植物内源激素的合成代谢与植物种子的发育成熟过程有着十分紧密的关系[30-31]，尤其是GA3和ABA在植物种子的休眠形成过程中起着主要作用并调控着种子的萌发，与本研究观点一致。说明GA3显著促进掌叶覆盆子种子萌发，同时，进一步说明采收时间对种子繁殖的重要性。

5 结 论

1) 掌叶覆盆子种子繁殖力的关键影响因素有：采种期、储藏时间、酸蚀+激素处理。

2) 掌叶覆盆子种子数量充足，群体内的结实特性保持着一致性，其果实的发育程度基本相同或相近。当年熟果种子活力达到75.33%，具深度休眠，酸蚀25 min和GA3(2 mg·L-1)+KNO3(34 mg·L-1)催芽是有效提高掌叶覆盆子发芽率和土出苗率的有效措施。

3) 熟果期是最佳采种时间。熟果和过熟果实种子活力达最高值且基本一致，但熟果GA3和GA3/ABA比值最大，发芽率也最高；不管是否添加外源激素，随着过熟程度加深，种子发芽率迅速下降，种子休眠程度也随之加深。

4) 储藏时间达1年及以上种子活力迅速下降至失活，且酸蚀后激素处理种子也难以萌发。