褚力嘉， 曹士亮， 靳羽晗， 李 帅， 刘宝民， 于 滔， 刘长华

(1.黑龙江大学农业资源与环境学院， 哈尔滨 150080；2.黑龙江省农业科学院玉米研究所， 哈尔滨 150086)

玉米属禾本科玉蜀黍属一年生植物[1]，是重要的粮食作物、饲料作物、工业用料之一，也是世界上总产量最高的农作物[2]。玉米属亚热带喜温作物，相比小麦、大麦等农作物而言，玉米对低温等非生物胁迫非常敏感[3]。低温影响玉米种子的萌发、幼苗生长、早期叶片发育和玉米的生长[4]。在10 ℃或以下低温的状态下，玉米生长将受到低温的限制继而影响产量。因此，选择培育具有抵抗低温能力的玉米品种是高纬度的地域对玉米育种的重要需求。

简便、准确的玉米耐冷性鉴定方法是开展耐冷品种选育的关键。玉米萌发期耐冷性的田间鉴定通常利用自然环境，通过调整播期创造低温条件。尽管田间鉴定法比较接近生产实际，能够客观直接地对玉米耐冷性进行评价，但田间耐冷性鉴定结果往往存在重复性差、需要占用大量的土地资源的不足。室内鉴定能够克服田间试验环境波动性大的缺点，结果重复性较好，适合开展大批量材料的鉴定，近年来被大量应用。北美官方种子检测协会(AOSA，Association of Official Seed Analysts)所指定的玉米耐冷性检测的规程就是采用采用室内鉴定方法[5]。

当前，对玉米萌发期耐冷性评价尚未有统一的标准。不同实验室由于采用的耐冷性鉴定和评价指标不尽相同，导致研究的结果相互之间不能有效的对比。谢皓研究认为，玉米生长适宜的温度范围内，发芽率、发芽指数和活力指数等指标均随着温度的升高而表现出递增趋势[6]。张晓聪等研究认为，相对发芽率、相对发芽指数、相对幼苗干重与相对活力指数可以作为玉米自交系芽期耐冷性鉴定指标[7]。刘春香等研究表明，建议采用幼苗生长的平均鲜重与发芽指数的乘积来表示活力指数，来对玉米的耐冷性进行评价[8]。近年来，对不同指标的综合分析在植物复杂性状的评价上显现出一定的优势。杨树明等对丽江新团黑谷近等基因系孕穗期耐冷性生化性状进行了主成分分析及综合评价，认为综合生化指标比用单一指标(部位)更能客观、真实、全面地反映水稻抗低温特性实质[9]。李琳等[10]采用主成分分析和隶属函数的方法对42份芸豆品种苗期的耐盐碱性进行综合评价，将11个单项形态指标转换成为5个相互独立的综合指标，并利用主成分分析赋予不同指标权重，最终确定材料的综合耐盐能力。

本研究在对玉米萌发过程中各单项指标进行分析的基础上，采用主成分分析、隶属函数分析及聚类分析的方法对各指标进行综合评价，最终采用耐冷性D值评价方法明确材料的耐冷性，期望对开展玉米耐冷性研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选取了20份玉米自交系材料，由黑龙江省农科院玉米研究所提供，编号分别为：J 1～J 20。

1.2 试验设计与测定方法

试验采用室内直接鉴定的方法，考察种子萌发不同时期生长发育状况、生长量，如发芽率、出苗率、根长、茎长、根茎鲜重、干重等耐冷性相关指标。分别选取颗粒大小均匀饱满、成熟度高的玉米种子，用0.5%的次氯酸钠溶液浸泡10 min。用蒸馏水对消毒过的种子进行3～5次冲洗直至玉米表面无次氯酸钠溶液残留。经以上处理后吸干供试材料表面的水分，放入铺有黑色海绵的培养皿中，每份材料选取100粒种子，2次重复。将恒温培养箱设置为温度12 ℃、湿度75%的低温环境。每周记录玉米种子的各项耐冷性相关指标，连续3周。每周统计生根率和发芽率，3周后。将种子转入装有蛭石的发芽盒中，25 ℃培养3 d，统计出苗率，每个品种的每个处理组中选出20株幼苗(不足20株的取整齐一致的幼苗进行测量)，用刻度尺测量茎长、根长。称量鲜重后将玉米种苗根、茎做标记后放入80 ℃的烘箱烘至恒定重量，取出置于分析天平测定重量，记录茎干重、根干重等数据。

1.3 数据处理与分析

1.3.1主成分分析

主成分分析是数据降维的一种方法。其基本思想是将原来众多的具有一定相关性的耐冷性指标X1，X2，…，XP(比如P个指标)，重新组合成一组较少个数的互不相关的综合指标，要求这些综合指标既能最大程度的反映原变量所代表的信息，又能保证新指标之间保持相互无关(信息不重叠)。主成分分析的步骤依次是计算协方差矩阵，求出协方差矩阵的特征值及相应的正交化单位特征向量，再通过方差(信息)累计贡献率来确定选择几个主成分。

1.3.2各综合指标的隶属函数值

(1)

式中,Xj表示第j个综合指标,U(Xj)表示第j个综合指标的隶属函数值，Xmin与Xmax分别表示第j个综合指标的最小值与最大值[10]。

1.3.3各综合指标的权重

(2)

式中,Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重，Pj为各基因型第j个综合指标的贡献率[9]。

1.3.4各品种的综合耐冷性D值

(3)

式中，D为各品种耐冷性综合评价值[10]。

本研的数据分析主要采用SPSS、DPS统计分析软件及Excel 2010软件进行。

表1 自交系各耐冷性状的表现

材料编号茎长/cm出苗率/%根长/cm茎鲜重/g根鲜重/g茎干重/g根干重/g1周生根率/%2周生根率/%3周生根率/%1周发芽率/%2周发芽率/%3周发芽率/%J12.7173.503.430.040.020.000.006.0022.5072.500.000.0018.50J23.9669.009.040.130.140.010.030.0049.5067.500.0029.5045.50J34.7080.008.490.190.200.010.0247.5068.0091.500.000.0043.50J45.9711.2513.500.210.250.020.0310.5015.5019.500.006.0011.50J52.1068.505.000.090.070.010.0113.5051.50100.000.0024.5070.50J62.9651.006.210.110.100.010.0149.0072.0077.500.0065.5068.50J74.1828.504.340.150.090.010.0144.5047.0056.000.0025.5041.00J87.1780.0010.920.290.250.030.03100.00100.00100.000.0085.00100.00J95.4551.0011.030.140.130.010.0263.5085.0087.500.0041.0073.50J104.5833.506.750.130.150.010.0210.0026.0046.000.000.0022.50J114.2042.008.380.100.090.010.0161.5087.5090.000.0028.5073.50J124.0540.506.130.130.050.010.0142.0052.0074.000.000.0046.00J136.0952.508.480.170.170.010.0218.0056.0068.000.0030.0045.00J147.5536.0010.600.200.120.020.0137.0057.0068.000.0015.5038.00J153.7040.007.800.090.060.010.0111.0024.5028.000.005.0028.50J164.4737.509.060.160.130.020.0316.0026.0030.500.000.0027.00J175.4480.5011.610.190.210.020.0276.0081.0088.500.0079.5079.50J184.6669.507.440.140.120.010.0231.0052.0080.500.0012.5046.50J193.7692.005.910.150.120.010.0179.5085.00100.000.0073.5091.50J206.6168.509.670.200.150.020.0225.5038.5047.500.0018.5026.00均值4.7155.268.190.150.130.010.0237.1054.8369.650.0027.0049.83标准差1.4521.482.610.050.060.010.0128.0024.7624.670.0028.0725.23变异系数0.310.390.320.360.480.380.440.750.450.350.001.040.51

表2 各性状单因素方差分析

变异来源茎长出苗率根长茎鲜重根鲜重茎干重自交系3.869**10.773**4.545**3.237**3.182**2.282*变异来源根干重1周生根率2周生根率3周生根率2周发芽率3周发芽率自交系3.369**12.368**5.747**8.312**13.141**11.294**

注：“*”表示在0.05水平上的显著性；“**”表示在0.01水平上的显著性。

2 结果与分析

2.1 玉米萌发期耐冷性单一性状表现

20份自交系在低温胁迫的茎长、出苗率、根长、茎鲜重、根鲜重、茎干重、根干重、1～3周生根率和1～3周发芽率等13个指标如表1所示。由表1可知，在茎长、出苗率等13个指标中，发芽率变化最大，低温处理1周时各自交系均未发芽，2周时部分自交系开始发芽，但发芽率表现差异很大，最大为85%，最小为0.00%，变异系数最大为1.04，3周时各自交系均有发芽，其中J 8自交系全部发芽。各自交系低温处理条件下每周生根率的变化较大，尤其是第1周生根率变异系数居13个指标第二位，为0.75，自交系J 8全部生根，J 2自交系均没有生根，说明J 8对低温具有一定的抗性，J 2对低温敏感，不耐低温。

总体看，13个指标的表现各不相同，均存在不同程度的变异，变异系数从大到小的顺序为：2周发芽率>1周生根率>3周发芽率>根鲜重>2周生根率>根干重>出苗率>茎干重>茎鲜重>3周生根率>根长>茎长>1周发芽率。方差分析结果(表2)表明，不同自交系的13个指标间差异均达极显著或显著水平，说明各自交系对低温的敏感性不同。

2.2 各单一耐冷指标间的相关性分析

对测定的12个指标进行相关性分析，结果(表3)表明，出苗率与3周生根率、3周发芽率、2周生根率、2周发芽率之间具有极显著或显著正相关，Pearson相关系数分别为0.71、0.55、0.51、0.55；与1周生根率、根鲜重和茎鲜重表现不显著的正相关趋势，而与茎长、根长、茎干重和根干重间具有不显著的负相关趋势。茎长与根长、茎鲜重、根鲜重、茎干重和根干重间具有极显著或显著正相关关系，相关系数分别为0.76、0.84、0.68、0.74、0.50；另外，根长与茎(根)鲜重及茎(根)干重间同样具有极显著正相关关系；茎鲜重与根鲜重、茎(根)干重间具有极显著正相关关系；根鲜重与茎(根)干重间具有极显著正相关关系；茎干重与根干重间相关性达极显著水平。由此证明，低温条件对玉米萌发期的生长发育产生影响，但各品种的玉米对低温的耐受性存在差异。但对出苗率的影响不大，主要影响出苗后玉米的生长质量。

表3 不同指标间的相关性分析

相关系数X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X12X13X11.00X2-0.121.00X30.76**-0.151.00X40.84**0.070.70**1.00X50.68**0.080.78**0.86**1.00X60.74**-0.040.73**0.88**0.71**1.00X70.50*-0.050.71**0.66**0.80**0.63**1.00X80.290.400.210.47*0.320.390.001.00X90.190.51*0.170.320.240.220.000.89**1.00X10-0.130.71**-0.200.02-0.03-0.12-0.250.65**0.84**1.00X120.150.50*0.200.360.350.360.100.77**0.78**0.58**1.00X13-0.010.55**0.050.210.160.20-0.030.83**0.93**0.83**0.86**1.00

注：“*”表示在0.05水平上的显著性；“**”表示在0.01水平上的显著性。X1为茎长(cm)；X2为出苗率(%)；X3为根长(cm)；X4为茎鲜重(g)；X5为根鲜重(g)；X6为茎干重(g)；X7为根干重(g)；X8为1周生根(%)；X9为2周生根(%)；X10为3周生根(%)；X12为2周发芽(%)；X13为3周发芽(%)。

表5 规格化特征向量

主成分茎长/cm出苗率/%根长/cm茎鲜重/g根鲜重/g茎干重/g根干重/g1周生根率/%2周生根率/%3周生根率/%2周发芽率/%3周发芽率/%CI10.26130.14730.25950.33480.30300.30330.19990.33610.31570.33600.31380.2879CI20.3031-0.27850.32730.25120.27660.26190.3465-0.2384-0.2986-0.2744-0.2373-0.3428CI3-0.29700.7037-0.0549-0.02750.2688-0.10390.4480-0.2658-0.0977-0.19230.10310.0360

2.3 主成分分析

2.3.1特征值与贡献率分析

对20个玉米自交系测定的耐冷性指标主成分分析后得到11个主成分，每一个主成分都独立客观的反映各玉米品种的耐冷性，主成分特征值如表4所示。由表4可知，前3个主分量所构成的信息量为总信息量的87.03%，将多个耐冷性指标进行降维后其信息量超80%，几乎反映了全部信息，所以只需要3个特征值所对应的特征向量作主成分。

2.3.2规格化特征向量及表达式

由于前3个主分量所构成的信息量为总信息量的87.03%，几乎反映了全部的信息。根据进一步的规格化特征向量结果(表5)可知，在这3个主分量中，第1主分量代表1周生根率、3周生根率、茎鲜重、2周生根率和2周发芽率，它们的权重系数分别为0.336 1、0.336、0.334 8、0.315 7和0.313 8，可归纳为第一主成分是生根发芽因子；第2个主分量代表根干重、根长和茎长，权重系数是0.346 5、0.327 3和0.303 1，可归纳为第二主成分是根茎生长因子。第3个主分量代表出苗率X6，权重系数0.703 7。可归纳为第三主成分是出苗率因子。

在第一个主成分中，1周生根率系数相对最大，为0.336 1，第二个主成分中，根干重的系数相对最大，为0.346 5，第三主成分中出苗率的系数相对最大为0.703 7，综合来看，1周生根率、根干重、出苗率可作为玉米萌发期耐冷性鉴定的指标。

表4 主成分特征值

主成分特征值百分率/%累计百分率/%15.913849.282149.282123.708030.900180.182230.82146.845387.0275

2.4 各材料萌发期耐冷性的综合评价

2.4.1隶属函数分析

表6 各自交系主成分分析得分、隶属函数及综合耐冷性

材料编号CI1CI2CI3U(X1) U(X2) U(X3)D值耐冷性J1-4.91 -1.85 0.54 0.06 0.00 0.77 0.10 较弱J2-0.71 0.78 1.94 0.00 1.00 0.72 0.42 一般J30.80 0.15 0.96 0.48 0.67 0.85 0.58 中等J40.10 4.98 -0.25 0.11 1.00 0.00 0.42 一般J5-2.01 -1.99 0.87 0.14 0.33 0.71 0.25 较弱J6-0.05 -2.39 -0.29 0.49 0.33 0.49 0.44 一般J7-1.33 -0.68 -1.27 0.45 0.33 0.21 0.39 一般J86.84 0.08 0.20 1.00 1.00 0.85 0.99 较强J91.79 -0.84 -0.66 0.64 0.67 0.49 0.64 中等J10-2.15 1.58 0.09 0.10 0.67 0.28 0.32 较弱J110.41 -2.02 -1.37 0.62 0.33 0.38 0.50 一般J12-1.60 -0.82 -1.13 0.42 0.33 0.36 0.39 一般J130.15 0.93 0.24 0.18 0.67 0.51 0.38 一般J140.83 1.59 -1.93 0.37 0.33 0.31 0.36 一般J15-2.98 0.32 -0.42 0.11 0.33 0.36 0.21 较弱J16-0.94 2.52 0.38 0.16 1.00 0.33 0.48 一般J173.91 -0.67 0.50 0.76 0.67 0.86 0.74 中等J18-0.56 -0.09 0.72 0.31 0.67 0.72 0.47 一般J191.91 -3.58 0.54 0.80 0.33 1.00 0.65 中等J200.48 2.01 0.34 0.26 0.67 0.71 0.44 一般权重———0.57 0.36 0.08 ——

采用公式(1)计算每一自交系各综合指标的隶属函数值(见表6)。每个自交系所有综合指标的隶属函数值不尽相同，对于同一综合指标如CI1而言，在低温胁迫下，材料J8的隶属函数U(X1)值最大(1.00)，同时也发现，该材料在第二个综合指标下的隶属函数U(X2)值也最大(1.00)，在第三个综合指标下的隶属函数值也相对较大为0.85，说明材料J 8具有相对较好的耐冷性。而材料J 1在第一和第二综合指标下的隶属函数值均最小(分别为0.06和0.00)，说明这个材料耐冷性较差。

2.4.2各综合指标权重的确定及材料耐冷性的综合评价

根据各综合指标贡献率的大小(分别为0.49、0.31和0.07)，利用公式(2)求出其权重分别为0.57，0.36和0.08(见表6)。采用公式(3)计算每个材料的综合耐冷性(D值)，并对其耐冷性进行强弱排序。其中J 8的D值最大，为0.99，表明耐冷性最强；J 1的D值最小，为0.10，表明其耐冷性最差。

采用标准化转换后的D值、欧氏距离及类平均法对这些材料的耐冷性进行聚类分析，结果见图1。这20份自交系按照综合耐冷性可大致分为四类，其中耐冷性较强的材料1份，为J 8，耐冷性中等的材料为J 3、J 9、J 17、J 19，耐冷性的D值变化范围为0.58～0.74，耐冷性一般的材料为J 2、J 4、J 18等11份，D值变化范围为0.36～0.50。耐冷性较弱的材料共有4份，分别为J 1、J 5、J 10、J 15，D值变化范围为0.10～0.32。

图1 供试材料耐冷性的聚类图

3 讨论与结论

萌发期耐冷性是高纬度地区玉米育种和生产面临的重要问题。低温造成玉米萌发出苗缓慢，加大病害发生几率，是造成玉米单产年际间波动较大的重要原因，因此，育种家十分重视玉米种质的耐冷性评价。随着所需鉴定的材料的增加，如何快速有效地对玉米种质耐冷性进行评价显得十分重要。本研究采用室内鉴定的方法对玉米自交系进行耐冷性鉴定不受季节等外界环境影响，试验周期不超过4周，一年四季均可开展。从表1中的单一指标来看，各材料不同指标排序不尽相同，如材料J 1的发芽率为73.50%，在所有材料中为第5位，而在茎鲜重这一指标中则位于最后一位，因此，可以看出单一指标很难全面反映材料的耐冷性。

采用哪些指标作为玉米萌发期耐冷性评价的标准目前尚未统一。扈光辉等认为，相对发芽指数、相对发芽率、相对苗干重、相对根干重和相对根总长适宜作为玉米芽期和苗期耐冷性鉴定指标[11]。张雪峰等认为，相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数和相对活力指数4项指标可以构建综合活力指标[12]。总的来看，综合指标要优于单一指标。就各单项指标进行综合评价时如何取舍以及是否需要对不同指标赋予不同的权重的问题来看，主成分分析及隶属函数分析方法的综合应用发挥了一定的优势。陈小凤等分别利用主成分值和综合隶属函数值对供试苦瓜资源进行耐冷性评价，结果显示，供试苦瓜资源的耐冷性两种方法排名大部分相同，少部分仅相差1～2个名次[13]。本研究通过主成分分析确定了3个主成分和每个主成分的权重，而综合耐冷性D值实际上是每个材料隶属函数和权重的乘积和。利用该值进行耐冷性的分析涵盖了更丰富的信息且体现了不同指标的重要程度，最终将20份供试玉米自交系分成4类，结果较为科学合理。

玉米萌发期耐冷性是玉米在低温条件下的一个复杂的生理代谢反应过程。低温会造成植物生物膜膜相的变化，降低酶活性，引起细胞生理生化过程的一些异常。从本研究中各单一指标的相关性分析来看，不同性状间的相关性差异较大，可以看出低温胁迫后的出苗率与2周的生根率显著相关，与3周的生根率极显著相关，这也是一些研究以玉米低温萌发初期的生根率作为耐冷性的鉴定的指标的原因之一。本研究以综合耐冷性D值为标准对材料的耐冷性进行了评价，要进一步明确综合指标与单一指标之间以及各单一指标之间的关系，还需要进行玉米耐冷性相关的各指标遗传基础研究。