赵玲燕，谭晓辉，龙运忠，胡鹏刚 *，娄兴维，江飞凤，潘雪梅

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；3.荔波昌辉食业有限公司，贵州 荔波 558400）

柚子（Citrus grandis）属芸香科柑橘属植物，具有“天然水果罐头”的美称[1-3]。其果实酸甜可口，含有多种氨基酸、β-胡萝卜素、抗坏血酸、烟酸等丰富营养成分；具有很高的药用价值，如抗衰老、抗氧化、抗癌、降血糖、降血压、降血脂等功效，备受消费者的青睐[4-6]。柚子发酵而成的柚子果酒因含有柚子中多种有益微量元素，不仅口感好，且具营养保健的特点，市场前景看好。

刚发酵出的柚子果酒中富含蛋白质、大量果胶质和纤维素等物质[7-8]，在储存过程中会出现浑浊、沉淀、失光等现象，严重影响柚子果酒的感官品质，因此，需要对发酵出的柚子果酒进行澄清处理。而澄清剂被广泛应用于其他果酒的澄清研究，澄清剂不仅处理效果好，还能最大程度的保留果酒中的有益物质，使果酒保留原有的色香味。澄清剂的澄清机理、性质和特点不同都会影响果酒的澄清效果[9]，硅藻土可以吸附果酒中一定的果胶、色素、酵母菌等固体悬浮物[10-11]；壳聚糖可与酒体溶液中带负电荷的微粒相互作用，使酒液浑浊的蛋白质、果胶、单宁等胶态颗粒絮凝沉淀[12]；木瓜蛋白酶可使果酒中大分子蛋白质降解为小分子的化合物，从而达到澄清效果[13-14]；明胶能与单宁作用生成一种粘糊状的化合物，吸附酒中的浑浊微粒[9，15]；交联聚乙烯吡咯烷酮（crosslinking polyvingypyrrolidone，PVPP）粒子间存在许多褶皱和微孔，可用于吸附澄清[16]；皂土能与酒中带正电荷的蛋白、多酚类物质结合，起到除蛋白、除酚作用[17]。同时复合澄清剂综合了多种澄清剂的优点，比单一澄清剂澄清效果好[18]。

本试验拟采用复合澄清剂法对柚子果酒进行澄清研究。首先研究硅藻土、壳聚糖、木瓜蛋白酶、明胶、PVPP和皂土6种单一澄清剂对柚子酒的澄清效果，然后从中选取澄清效果较好的澄清剂进行复合试验，采用正交试验分析复合澄清剂配比、处理温度和处理时间对柚子果酒澄清效果的影响，获得最佳的澄清工艺，为后续柚子果酒研究和规模化生产柚子果酒提供一定的的技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柚子发酵酒：贵州荔波昌辉食业有限公司；皂土、PVPP（食品级）：烟台帝伯仕自酿机有限公司；木瓜蛋白酶（食品级，酶活力100 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；可溶性壳聚糖、明胶（食品级）：万利达生物科技有限公司；硅藻土（食品级）：云南省腾冲县助滤剂厂；氢氧化钠：天津市永大化学试剂有限公司；硫酸：重庆川江化学试剂厂；无水葡萄糖：天津市协和昊鹏色谱科技有限公司；次甲基蓝、酚酞：天津市化学试剂供销公司；盐酸：四川西陇化工有限公司。试验所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ224 BC型电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；723可见分光光度计：天津冠泽科技有限公司；DH5000 Ⅱ型恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；DFDS-700型恒温水浴锅：天津市莱悦纳格实验室仪器销售有限公司；50型附温度计密度瓶：海门市测温仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 澄清剂的配制

1%壳聚糖溶液：准确称取1.0 g壳聚糖，加入97.0 mL去离子水加热溶解，再加入2.0 mL冰醋酸，缓慢加热溶解，边加热边搅拌，使之溶解冷却备用。

4%皂土悬浊液：准确称取4.0 g皂土，用96.0 mL去离子水浸泡24 h后充分搅拌，配成悬浮液备用。

1%明胶溶液：准确称取1.0 g明胶，用99.0 mL去离子水浸泡过夜，缓慢加热溶解，边加热边搅拌，冷却备用。

4%硅藻土溶液：准确称取4.0 g硅藻土，用96.0 mL水浸泡，配成悬浮液。

2%PVPP溶液：准确称取2.0 g PVPP，用98.0 mL去离子水浸泡过夜，缓慢加热溶解，冷却备用。

1%木瓜蛋白酶溶液：准确称取1.0 g木瓜蛋白酶，用99.0 mL去离子水浸泡过夜，配成1%木瓜蛋白酶溶液备用。

1.3.2 单一澄清剂的确定试验

表1 6种澄清剂单因素试验水平Table 1 Levels of single factor experiments of 6 clarifying agents

经预试验后，取20.0 mL柚子果酒样品于比色试管中，分别按表1试验方案加入澄清剂，充分混匀后，在室温条件下静置12 h后，取上清液在波长640 nm处测其透光率（下同），确定各澄清剂最佳添加量，并对最佳添加量条件下的柚子果酒进行感观品鉴。

1.3.3 复合澄清剂试验

（1）单因素试验

配比的确定：根据1.3.2研究结果，取皂土和壳聚糖作为复合澄清剂，取20.0 mL柚子果酒于比色管中，分别按皂土和壳聚糖质量比为0.50∶1、1.00∶1、1.50∶1、2.00∶1、2.50∶1、2.57∶1、3.00∶1、3.50∶1、4.00∶1加入（总添加量2.5 g/L），混合均匀，在室温下静置12 h，取上清液测定其透光率。

澄清温度的确定：根据上述试验所得出的结果，取20.0 mL柚子果酒于比色管中分别于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃温度条件下静置12 h后，取其上清液测定透光率。

澄清时间的确定：取20.0 mL柚子果酒于比色管中，添加皂土-壳聚糖复合澄清剂后，在最佳温度下静置4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h，取其上清液测定透光率。

（2）正交试验

在单因素试验的基础上，以透光率作为评价指标，选择复合澄清剂配比（A）、处理温度（B）和处理时间（C）作为考察因素，依照L9（33）进行3因素3水平正交试验。正交试验的因素与水平见表2。

表2 澄清工艺优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for clarification technology optimization

1.3.4 分析方法及理化指标的测定

总糖：斐林试剂法[19]；总酸（以酒石酸计）：酸碱指示剂法[19]；酒精度：密度瓶法[19]；澄清度的测定：以蒸馏水为参比，于640 nm波长处测其透光率；感官评定：成立5人小组，以百分制进行感官评价，去掉最高分和最低分，取其平均值作为最终评分，其中评分标准参考罗光琳[20]的文献。

2 结果与分析

2.1 单一澄清剂的确定试验

2.1.1 硅藻土添加量对柚子果酒澄清效果的影响

由图1可知，随着硅藻土添加量增加，柚子果酒的透光率总体呈现出先增加后减少，最终趋于稳定的趋势。当硅藻土添加量从0.2 g/L增加至0.8 g/L时，柚子果酒透光率迅速上升至最大值71.6%。其后，随添加量的增加，透光率逐渐降低且趋于稳定。

图1 硅藻土添加量对柚子果酒澄清的影响Fig.1 Effect of f diatomite addition on clarification of grapefruit wine

2.1.2 壳聚糖添加量对柚子果酒澄清效果的影响

由图2可知，在壳聚糖添加量的范围内，透光率先随壳聚糖添加量的增大而增大后呈平稳的趋势。壳聚糖添加量从0.4 g/L增加至0.7 g/L时，柚子果酒的透光率逐渐增大；当添加量为0.7 g/L时，透光率达82.2%，后趋于稳定。

2.1.3 木瓜蛋白酶添加量对柚子果酒澄清效果的影响

由图3可知，随着木瓜蛋白酶添加量逐渐增加，柚子果酒透光率总体呈现先增加后降低的趋势。木瓜蛋白酶添加量在0.1～0.6 g/L范围内时，透光率逐渐增大；当添加量为0.6 g/L时，透光率达到最大值61.7%；其后，透光率随着添加量的增加而降低。

图3 木瓜蛋白酶添加量对柚子果酒澄清的影响Fig.3 Effect of papain addition on clarification of grapefruit wine

2.1.4 明胶添加量对柚子果酒澄清效果的影响

由图4可知，明胶对柚子果酒的澄清效果不明显，澄清处理后的柚子果酒最大透光率仅有63.8%。在明胶添加量在0.05～0.20 g/L范围内时，柚子透光率明显增加；在0.20～0.35 g/L范围内时，透光率逐渐降低。

图4 明胶添加量对柚子果酒澄清的影响Fig.4 Effect of gelatin addition on clarification of grapefruit wine

2.1.5 PVPP添加量对柚子果酒澄清效果的影响

由图5可知，随着PVPP添加量的增加，柚子果酒的澄清度在0.1～0.7 g/L范围内时透光率逐渐升高，当PVPP添加量为0.7 g/L时，透光率最大为73.6%；添加量大于0.7 g/L时，透光率开始降低。

图5 PVPP添加量对柚子果酒澄清的影响Fig.5 Effect of PVPP addition on clarification of grapefruit wine

2.1.6 皂土添加量对柚子果酒澄清效果的影响

图6 皂土添加量对柚子果酒澄清的影响Fig.6 Effect of bentonite addition on clarification of grapefruit wine

由图6可知，在整个皂土的处理范围内，随着添加量的增加，柚子果酒的澄清度在逐渐的升高，添加量达到1.8 g/L后，透光率趋于稳定。这可能是因为在澄清处理前期中带有负电荷皂土胶体微粒吸附果酒中带有正电荷的物质（如纤维素，蛋白质及含氮物质等），所以澄清效果明显；但是当皂土的添加量到最优值时，整个果酒体系已经达到了一个吸附平衡状态，即使再添加皂土，果酒的透光率变化也很小。取1.8 g/L作为皂土的最佳添加量，此时透光率为84.8%。

2.1.7 6种澄清剂对柚子果酒澄清效果的比较

6种澄清剂在各自的最佳添加量条件下对柚子果酒澄清效果的比较见图7所示。

图7 6种澄清剂对柚子果酒澄清效果的比较Fig.7 Comparison of clarification effects of 6 clarifiers on grapefruit wine

由图7可知，硅藻土、PVPP和皂土3种澄清剂对柚子果酒有较明显的作用。皂土的澄清效果最佳，透光率为84.8%，澄清后的感官评分最高，为88分；而综合透光率（82.2%）和感官评分（85分）壳聚糖澄清效果次之。所以，皂土和壳聚糖是单一澄清剂的首选。相较而言，硅藻土和PVPP虽有较明显的澄清效果，但综合透光率和感官评分来看，都没有皂土和壳聚糖的澄清效果佳，故选择皂土和壳聚糖为最终的复合澄清剂。

2.2 复合澄清剂优化单因素试验

2.2.1 复合澄清剂配比对柚子果酒的澄清效果的影响

图8 皂土-壳聚糖质量比对柚子果酒澄清的影响Fig.8 Effect of bentonite-chitosan ratio on clarification of grapefruit wine

由图8可知，皂土和壳聚糖质量比在0.50∶1～1.00∶1范围时，透光率随着皂土-壳聚糖质量比的增大而增大；在1.00∶1～2.50∶1范围内，随着复合澄清剂配比的逐渐增大，透光率呈现下降的趋势，其中当皂土-壳聚糖质量比为2.57∶1时，透光率为89.1%。当皂土-壳聚糖质量比为1.00∶1时，透光率最大，所以选取的皂土-壳聚糖质量比为1.00∶1，透光率为90.3%。

2.2.2 处理温度比对柚子果酒的澄清效果的影响

由图9可知，当处理温度从20 ℃升高至35 ℃时，柚子果酒的透光率逐渐增大；在35 ℃时透光率达到最大值为90.7%，但处理温度大于35 ℃时，透光率开始降低。因此，最适宜的处理温度为35 ℃。

图9 处理温度对柚子果酒澄清的影响Fig.9 Effect of treatment temperature on clarification of grapefruit wine

2.2.3 处理时间对柚子果酒的澄清效果的影响

由图10可知，柚子果酒的透光率随着处理时间的延长先增大后降低。处理时间在4～12 h之间时，透光率前期明显增大，后期缓慢增大；当处理时间长于12 h时，柚子果酒透光率逐渐降低。考虑到澄清效果和生产效率问题，选取12 h为最优处理时间，此时透光率为90.8%。

图10 处理时间对柚子果酒澄清的影响Fig.10 Effect of treatment time on clarification of grapefruit wine

2.3 正交试验优化复合澄清剂澄清柚子果酒工艺条件

根据上述的单因素试验结果综合分析，以柚子果酒透光率为评价指标，选择皂土-壳聚糖复合澄清剂配比（A）、处理温度（B）、处理时间（C）3个因素进行正交试验，试验结果与分析见表3。

表3 复合澄清剂澄清工艺优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for compound clarifiers clarification process optimization

由表3可知，3个因素对透光率影响程度的大小为A＞B＞C，即皂土-壳聚糖复合澄清剂＞处理温度＞处理温度。柚子果酒澄清工艺最佳处理条件为A1B2C1，皂土-壳聚糖复合澄清剂质量比为0.75∶1、处理温度35 ℃、处理时间11 h。在此最优澄清条件下柚子果酒的透光率为91.7%，感官评分为91分。

2.4 复合澄清剂澄清处理柚子果酒质量评价

由表4可知，澄清处理后的柚子果酒各项理化指标变化不大，透光率显著提高，澄清后的果酒外观较清澈透明，感官品评优于未处理前的柚子果酒。

表4 复合澄清剂澄清效果评价比较Table 4 Comparison of clarification effect of compound clarifiers

3 结论

分别采用硅藻土、壳聚糖、木瓜蛋白酶、明胶、PVPP和皂土6种澄清剂对柚子果酒进行澄清研究。结果表明，皂土、壳聚糖、硅藻土三种澄清剂对柚子果酒的澄清效果较好，其中皂土和壳聚糖澄清效果最好。选则皂土和壳聚糖进行复合澄清正交试验研究，最终获得柚子果酒澄清的最佳工艺条件为：皂土-壳聚糖澄清剂质量比为0.75∶1、处理温度35 ℃、处理时间11 h。在此优化下，所得柚子果酒澄清效果最好，透光率可达91.7%，比未使用澄清剂时提高了35.5%，且对果酒酒精度、总糖、总酸影响不大。因此说明皂土-壳聚糖复合澄清剂是一种良好有效的柚子果酒澄清剂，可以为企业规模化生产柚子果酒提供一定的的技术指导。