温媛媛，杨志强，徐勇飞，钱立勇

（舟山医院，浙江 舟山 316021）

含半胱天冬酶募集结构域的膜相关鸟苷酸激酶蛋白（CARMA）家族包括 CARMA1、CARMA2 和CARMA3（又称“CARD10”）三个成员，CARMA 家族蛋白成员在人核转录因子（NF-κB）激活中发挥重要的生物学作用[1]。CARMA蛋白在不同组织中表达各异，在病理状态下CARMA3在卵巢癌等恶性肿瘤中呈高表达，且与肿瘤细胞增殖、侵袭关系密切[2]。金属蛋白酶家族-9（MMP-9）的表达与许多肿瘤的恶性进展、细胞转移和不良预后相关[3]。本研究检测乳腺浸润性导管细胞癌中CARMA3与MMP-9的表达，同时在乳腺癌细胞中转染CARMA3表达质粒后观察CARMA3与MMP-9的表达情况，并分析转染后对乳腺癌细胞增殖、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 选取本院2018年1-12月收治的90例乳腺浸润性导管癌组织石蜡标本，并选取其癌旁正常乳腺组织作为对照。实验用细胞系：人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，人乳腺癌细胞系MCF-7与MDA-MB-435，均为贴壁生长细胞系，且均接种在DMEM培养液 （含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）中，于37℃含5% CO2湿润空气的培养箱中培养。SP免疫组织化学检测试剂盒（中国福州迈新生物技术公司）；CARMA3抗体（Sigma），MMP-9 抗体（Cell Signaling），β-actin 抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；CARMA3表达质粒 pCMV6-CARMA3 购于 OriGene （Rockville）；Lipofectamine 2000（Invitrogen）；RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒（TaKaRa），PCR引物合成与测序委托大连TaKaRa公司进行。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 组织标本经10%中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋，制成4μm厚度切片。采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶SP法，按试剂盒说明书步骤进行抗 CARMA3（1:200）、MMP-9（1:500）抗体免疫组织化学染色，PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照，观察CARMA3与MMP-9蛋白在乳腺组织中的表达。用半定量法评价CARMA3与MMP-9在肿瘤区域的免疫染色。各切片在光镜下随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞的百分比。CARMA3与MMP-9均以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色，两者染色强度分为三个等级:0级为阴性，1级为中等着色，2级为强着色；染色百分率分为4个等级：1级为1%～25%，2级为26%～50%，3级为51%～75%，4级为76%～100%。积分=染色强度等级×染色百分率等级，积分＜4判定为阴性或低表达，积分≥4为阳性或高表达。

1.2.2 细胞转染 采用细胞转染实验将pCMV6-CARMA3质粒导入乳腺癌细胞MCF-7构建CARMA3过表达细胞系。具体步骤：对乳腺癌MCF-7细胞以5×105每孔的密度接种于6孔板中进行转染，阴性对照为空载体组，将20μg pCMV6-CARMA3、20μg空载体、10μg MMP-9 siRNA、10μg control siRNA分别于1.5mL双无培养基室温下混匀，取60μL脂质体于1.5mL双无培养基混匀，室温孵育5分钟，将稀释后的质粒与Lipofectamine2000混匀，室温孵育30分钟，将上述混合液加入待转染细胞MCF-7中，6小时后换正常培养基，转染48小时后收集细胞，进行下一步检测。共转染pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA，方法按上述步骤转染pCMV6-CARMA3，36小时后收集细胞检测。实验分为pCMV6-CARMA3组、空载体组、control siRNA组、MMP-9 siRNA组和共转染pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA组。

1.2.3 CARMA3与MMP-9蛋白的表达 采用Western blot法对比乳腺癌细胞系与乳腺正常上皮细胞系中CARMA3与MMP-9蛋白的表达。收集乳腺癌及乳腺正常上皮细胞，提取总蛋白，加样，上样蛋白量为60μg。聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳，转膜，室温下5%正常小牛血清封闭2小时，加入一抗，一抗分别为兔抗人 CARMA3（1:200），山羊抗人MMP-9（1:1000）和鼠抗人 β-actin（1:200），4℃孵育过夜。然后加入二抗（1:2000）中，室温孵育2小时，ECL发光。

1.2.4 CARMA3与MMP-9mRNA的表达 采用RT-PCR法检测乳腺癌细胞与乳腺正常上皮细胞系中CARMA3与MMP-9 mRNA的表达。使用Trizol试剂提取细胞总RNA后逆转录获得cDNA，进行PCR反应。PCR引物经在GeneBank上Blast比对后合成，以β-actin为内对照。PCR引物分别为：（1）CARMA3：上游：5′-CCCCTAAGAGATCCTTCAGCAG-3′， 下游：5′-CCACACGCTGTCAGAGGATG-3′；（2）MMP-9：上游：5′-ACTTTGACAGCGACAAGAAGTG-3′，下游：5′-GGCACTGAGGAATGATCTAAGC-3′；（3）β-actin：上游：5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′，下游：5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′。 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后成像分析。

1.2.5 细胞增殖能力检测 采用MTT法检测各组细胞增殖能力。将各组细胞悬液分別接种于96孔培养板中，每孔含1×104个细胞，培养24小时，每孔加入MTT溶液继续培养4小时，加入DMSO，490nm波长下测定各孔吸收值，以不含细胞的等体积培养基作对照，绘制细胞生长曲线。

1.2.6 细胞侵袭能力检测 利用基质胶侵袭实验（Transwell法）分析各组细胞的侵袭能力。在孔径为8mm的24孔Transwell小室，上室中加入100μL预冷Matrigel基质胶，下室中加入600μL含10%胎牛血清DMEM培养基，将转染后24小时的细胞接种到人工基底膜室上部培养32小时，PBS清洗，甲醇固定，苏木素染色，室温干燥过夜。取下微孔膜，置载玻片上，显微镜下计数侵袭至滤膜下表面的细胞数，每张滤膜随机计数10个视野（×400），取平均值。实验重复3次，取平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件分析数据，计量资料用（±s）表示，采用 Spearman 等级相关分析CARMA3和MMP-9表达的关系，RTPCR、Western blot及细胞凋亡实验结果均采用配对t检验。

2 结果

2.1 免疫组化表现 SP染色后可见CARMA3、MMP-9在乳腺正常组织中呈低表达或不表达，但两者在乳腺浸润性导管癌中呈高表达，均定位于细胞质。详见图1-4。

图1 CARMA3在乳腺正常组织中呈低表达或不表达（SP×200）

图2 MMP-9在乳腺正常组织中呈低表达或不表达（SP×200）

图3 CARMA3在乳腺浸润性导管癌中呈高表达，定位于细胞质（SP×200）。

图4 MMP-9在乳腺浸润性导管癌中呈高表达，定位于细胞质（SP×200）。

2.2 乳腺癌细胞转染后CARMA3和MMP-9的表达 CARMA3 mRNA与蛋白在MDA-MB-435与MCF-7中表达均明显高于乳腺正常上皮细胞系MCF-10A，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表 1、图5。与空载体组相比，在MCF-7中转染pCMV6-CARMA3 48小时后，CARMA3、MMP-9的 mRNA与蛋白表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表 2、图 5。

表1 CARMA3在不同乳腺细胞系的相对表达量（±s）

表1 CARMA3在不同乳腺细胞系的相对表达量（±s）

与MCF-10A细胞系比较*P＜0.05

细胞系 CARMA3 mRNA CARMA3蛋白MCF-10A 0.56±0.05 0.47±0.04 MCF-7 1.28±0.10* 1.06±0.09*MDA-MB-435 1.73±0.15* 1.48±0.13*

表2 MCF-7细胞转染pCMV6-CARMA3后CARMA3与MMP-9 的相对表达（±s）

表2 MCF-7细胞转染pCMV6-CARMA3后CARMA3与MMP-9 的相对表达（±s）

与空载体组比较*P＜0.05

M M P-9蛋白空载体组 0.9 5±0.1 1 1.0 8±0.1 0 1.1 5±0.4 3 1.0 8±0.3 8 p C M V 6-C A R M A 3 组 4.0 2±0.9 7*3.5 4±0.8 2*2.8 4±0.6 8*2.4 9±0.5 5*转染分组 C A R M A 3 m R N A C A R M A 3蛋白M M P-9 m R N A

图5 乳腺癌细胞系MCF-7中过表达CARMA3可上调MMP-9表达。5A：CARMA3 mRNA在乳腺癌细胞系MCF-7与MDA-MB-435中表达高于乳腺正常上皮细胞系MCF-10A；5B：CARMA3蛋白在乳腺癌细胞系MCF-7与MDAMB-435中表达高于乳腺正常上皮细胞系MCF-10A；5C：与转染空载体组相比，乳腺癌细胞系MCF-7中转染pCMV6-CARMA3质粒后CARMA3与MMP-9 mRNA表达均增加；5D：与转染空载体组相比，乳腺癌细胞系MCF-7中转染pCMV6-CARMA3质粒后，CARMA3与MMP-9蛋白表达增加。

2.3 CARMA3、MMP-9表达与乳腺癌细胞增殖的关系 在乳腺癌细胞系MCF-7中采用MMP-9 siRNA沉默MMP-9的表达，瞬时转染MMP-9 siRNA 48小时后，MMP-9 mRNA与蛋白表达在MMP-9 siRNA组表达较control siRNA组下调，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表 3、图 6A-6B。 将MCF-7细胞分成两组，一组共转染pCMV6-CARMA3与MMP-9 siRNA，一组单独转染pCMV6-CARMA3，共转染pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA组MMP-9 mRNA与蛋白表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表 4、图 6C-6D。 与空载体组相比，MCF-7细胞转染pCMV6-CARMA3 3-5天后其增殖能力增加；MCF-7细胞共转染pCMV6-CARMA3与MMP-9 siRNA 3-5天后，与转染pCMV6-CARMA3组相比细胞增殖能力下降；与control siRNA组、MMP-9 siRNA组相比增殖能力无明显差别，详见图6E。

图6 乳腺癌细胞系MCF-7中过表达CARMA3可促进乳腺癌细胞增殖。6A：与control siRNA组相比，MCF-7中转染MMP-9 siRNA后MMP-9 mRNA表达减弱；6B：与control siRNA组相比，MCF-7中转染MMP-9 siRNA后MMP-9蛋白表达减弱；6C：与单独转染pCMV6-CARMA3质粒相比，MCF-7中共转染pCMV6-CARMA3与MMP-9 siRNA后，MMP-9 mRNA表达减弱；6D：与单独转染pCMV6-CARMA3质粒相比，MCF-7中共转染pCMV6-CARMA3与MMP-9 siRNA后，MMP-9蛋白表达减弱；6E：与单独转染pCMV6-CARMA3质粒相比，乳腺癌细胞系MCF-7中共转染pCMV6-CARMA3与MMP-9 siRNA 3-5天后，乳腺癌细胞增殖能力减弱。

表3 MMP-9 mRNA与蛋白的相对表达量（±s）

表3 MMP-9 mRNA与蛋白的相对表达量（±s）

与control siRNA组比较*P＜0.05

组别 MMP-9 mRNA MMP-9蛋白control siRNA 组 1.78±0.48 1.56±0.43 MMP-9 siRNA 组 0.31±0.05* 0.28±0.06*

表4 CARMA3、MMP-9的mRNA与蛋白在MCF-7各转染组中的相对表达量（±s）

表4 CARMA3、MMP-9的mRNA与蛋白在MCF-7各转染组中的相对表达量（±s）

与pCMV6-CARMA3组比较*P＜0.05

M M P-9蛋白p C M V 6-C A R M A 3 组4.5 6±0.9 1 4.0 5±0.6 8 2.6 4±0.4 3 2.0 4±0.4 0 p C M V 6-C A R M A 3+M M P-9 s i R N A组 3.9 2±0.9 5 3.6 7±0.5 9 0.5 9±0.0 9*0.5 5±0.0 5*转染组别 C A R M A 3 m R N A C A R M A 3蛋白M M P-9 m R N A

2.4 CARMA3、MMP-9表达与乳腺癌细胞侵袭能力的关系 转染pCMV6-CARMA3组与空载体组比较，通过基质胶的细胞数明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与转染pCMV6-CARMA3组相比，共转染pCMV6-CARMA3与MMP-9 siRNA后通过基质胶的细胞数目减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。与control siRNA组比较，转染MMP-9 siRNA后通过基质胶的细胞数减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。 详见表 5、图 7-8。

图7 显微镜下各组侵袭的乳腺癌细胞数（×400）。7A：空载体组；7B：pCMV6-CARMA3组；7C：pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA 组；7D：MMP-9 siRNA 组；7E：control siRNA 组。

图8 各组侵袭的乳腺癌细胞数比较

表5 各组穿透基质胶细胞个数（±s）

表5 各组穿透基质胶细胞个数（±s）

与空载体组比较△P＜0.01；与pCMV6-CARMA3组比较#P＜0.01；与 control siRNA 组比较 *P＜0.05。

穿透个数空载体组 1 4 5.0±1 9.0 p C M V 6-C A R M A 3 组 3 8 9.0±2 8.0△p C M V 6-C A R M A 3+M M P-9 s i R N A 组 1 6 4.0±1 6.0#M M P-9 s i R N A 组 3 4.0±8.0*c o n t r o l s i R N A 组 1 5 2.0±1 7.0组别

3 讨论

研究发现，CARMA3在许多肿瘤发生中起重要作用，且CARMA3高表达与肿瘤高TNM分期、淋巴结转移和Ki67增殖指数密切相关，CARMA3可通过NF-κB调控Cyclin D1来促进细胞增殖[4]。CARMA3在肾细胞癌中表达高于配对的癌旁正常肾脏组织，且CARMA3高表达与肿瘤的高分期和低分化呈正相关、与肾细胞癌患者的不良预后相关[5]。本组免疫组化结果发现，CARMA3在乳腺浸润性导管癌中呈高表达，在乳腺正常组织中不表达或低表达，在乳腺癌细胞中CARMA3蛋白和mRNA表达均高于乳腺正常上皮细胞。有研究发现，在非小细胞肺癌[6]与胰腺癌[7]中沉默CARMA3表达可抑制非小细胞肺癌细胞与胰腺癌细胞增殖与侵袭。在胆管细胞癌中抑制CARMA3表达可诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖和侵袭[8]。本研究在乳腺癌细胞中转染CARMA3表达质粒后发现乳腺癌侵袭能力增强，同时观察到过表达CARMA3后乳腺癌细胞生长增殖能力均明显提高。这些结果提示，CARMA3作为癌基因在乳腺癌恶性表型中发挥一定的作用。

MMP-9属于基质金属蛋白酶（MMPs）家族成员，能降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原，在肿瘤的生长、侵袭和转移中发挥重要作用[9]。CARMA3可通过G protein-coupled受体来诱导NF-κB激活，参与调控MMP-9表达来促进细胞侵袭[10]。NF-κB转录因子家族参与了肿瘤进展和转移，NF-κB可通过上调一系列细胞增殖因子如Cyclin D1、c-myc和细胞凋亡抑制因子来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡[11]。另外，NF-κB激活可通过上调MMP家族蛋白表达来促进肿瘤细胞侵袭[12]。本研究免疫组化发现，MMP-9蛋白在乳腺浸润性导管癌中呈高表达。转染CARMA3表达质粒pCMV6-CARMA3后发现，过表达CARMA3可上调MMP-9表达。本研究采用MMP-9 siRNA干扰MMP-9表达，与单独转染pCMV6-CARMA3相比，乳腺癌细胞共转染pCMV6-CARMA3与MMP-9 siRNA，其细胞增殖和侵袭力明显减弱，这些结果提示CARMA3可通过上调MMP-9表达来促进乳腺癌细胞增殖和细胞侵袭。

综上，CARMA3在乳腺癌恶性进程中发挥一定作用，CARMA3可能通过调控MMP-9表达来影响乳腺癌的生物学行为。