曾建亮，邓全恩，李建安，程军勇，邓先珍，姜德志

（1.中南林业科技大学 a.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；b.经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室；c.经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心；d.南方丘陵山地生态经济林产业工程技术研究中心，湖南 长沙 410004；2.湖北省林业科学研究院，湖北 武汉 430075）

植物在长期的进化过程中，为适应外界环境往往会改变自身结构，形成了一系列特定的外部形态特征，并影响其子代的生长、发育和生理特征。叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的主要器官，易受环境变化的影响，其形态解剖结构特征不但与叶片的生理功能密切相关，而且反映了树木对环境变化的响应和适应情况[4-5]。滕尧等[6]在对西番莲低温胁迫的研究中发现，耐寒性较强的品种其叶片的栅海比高、组织结构紧密度大，温度下降时这一特点更加明显。郭学民等[7]在研究桃叶片解剖结构与树干耐寒性的关系时发现，叶片厚度、单位面积气孔总周长、栅海比和主脉木质部面积都是影响其耐寒性的主要叶指标，他们据此评价桃树耐寒性的结果与大田调查结果一致。大量研究结果都表明，在植物的耐寒性研究中，叶片形态解剖结构特征可被作为一个重要评价指标，在不同品种间虽然主要评价指标有所差异，但研究者普遍认为，叶片结构越紧密则其耐寒性越好，反之越差[8-11]。为给油茶引种提供参考依据，本研究选取湖北省林业科学研究院武汉市九峰苗木基地上不同的油茶种质资源，对其叶片解剖结构进行了观测，初步评价了不同品种油茶的耐寒性，现将研究结果分析报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验地概括

试验地为湖北省林业科学研究院试验林场武汉市九峰苗木基地。该地属亚热带季风性湿润气候区，年降水量达1 100 mm；每年7—8月气温最高，1月气温最低，1月平均气温0.4 ℃，极端最低气温可至-18.1 ℃。

1.2 试验材料

供试的油茶品种分别为岑软3号、鄂油54号、赣州油8号、长林4号、鄂油102号、大别山1号，其树龄为6～8 a，其长势均良好，栽培环境条件和管理措施基本一致。于2018年1月采取不同品种油茶树同一部位的新鲜成熟叶片，在叶片中部取约1 cm2的小片，立即放入FAA溶液中保存以备用。

1.3 试验方法

1.3.1 叶片解剖结构的观察

采用常规石蜡切片技术制作叶片样本，用显微镜观察、拍照。每张切片各观察3个视野，利用Photoshop CS 6.0软件测定叶片厚度（leaf thickness）、上表皮厚度（thickness of upper epidermis）、栅栏组织厚度（thickness of palisade tissue）、海绵组织厚度（thickness of spongy tissue）、下表皮厚度（thickness of lower epidermis），计算栅海比（palisade tissue-spongy tissue ratio）、组织结构紧密度（tightness of tissue structure）和组织结构疏松度（looseness of tissue structure）及变异系数（coefficient of variation,CV），计算公式分别如下：

栅海比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度；

组织结构紧密度=栅栏组织厚度/叶片厚度；

尽管他们的作品稚嫩，但我还是给予最大的支持和鼓励。有东西可写，又有了精神支持者，他们就不会太受拘束，放开手脚地去写。现在有好几个同学积极地去投稿，有的同学还自己给自己的作品找了家——自己出写作小集子。我为他们加油，自己也努力去做他们创作路上的导航人。

组织结构疏松度=海绵组织厚度/叶片厚度；

变异系数=（标准差/平均值）×100。

1.3.2 气孔的观察

采用指甲油印迹法制片，在显微镜及其成像系统下观察、拍照。利用Photoshop CS 6.0软件测定气孔密度（stoma density），然后计算变异系数（CV）。

1.4 数据分析

利用Excel和SPSS 19.0进行数据分析。

采用隶属函数法评价不同品种油茶的耐寒性。若该指标与耐寒性呈正相关，则计算公式为式（1），若该指标与其耐寒性呈负相关，则计算公式为（2）。

式（1）和（2）中：U(Xi)为耐寒隶属函数值；i为某项指标，Xi为某项指标的测定值；Xmin和Xmax分别为某项指标测定值的最小值和最大值。根据筛选的典型指标计算各油茶品种的平均隶属度，数值越大则表明其耐寒性越好。

2 结果与分析

2.1 叶片结构特征比较

2.1.1 叶片厚度比较

植物叶片厚度受气温、空气湿度及光照强度等因素的影响，在湿冷环境下叶片较厚，其含水量则高，而寒冷环境可延缓叶片遭受低温的损害。6个油茶品种叶片组织结构的观测结果见表1。由表1可知，6个油茶品种叶片厚度为346.84～404.17 μm，且其差异显著，其中，鄂油54号的叶片最厚，而岑软3号的叶片最薄。

表1 6个油茶品种叶片组织结构的观测结果†Table 1 Observation results of tissue structures in leaves of six C.oleifera cultivars

2.1.2 叶片表皮特征比较

油茶叶片为异面叶，上表皮和下表皮均为单层排列紧密的不规则长方形细胞，且上表皮厚度均大于下表皮厚度，其厚度差异显著。6个油茶品种的上表皮厚度为18.80～26.29 μm，下表皮厚度为15.20～21.18 μm，大别山1号的上表皮和下表皮厚度均大于其他品种的表皮厚度，而岑软3号和鄂油54号的上表皮和下表皮厚度均较薄。

油茶气孔主要分布在下表皮，6个油茶品种叶片的横切面和下表皮的气孔显微结构分别如图1和2所示。由图1可知，油茶叶片的气孔为椭圆形或长圆形，6个油茶品种叶片下表皮的气孔密度为172.92～266.67 个·mm-2，其差异极显著，赣州油8号的气孔密度最大，岑软3号的气孔密度最小。气孔与植物水分及气体交换均密切相关，从而影响油茶叶片的耐寒性。

图1 6个品种油茶叶片的横切面Fig.1 Leaf cross sections of six C.oleifera cultivars

图2 6个油茶品种叶片下表皮的气孔显微结构Fig.2 Microscopic structures of stomata in leaf lower epidermis of six C.oleifera cultivars

2.1.3 叶肉组织结构特征

从图1中可以观察到，岑软3号的叶肉结构明显不同于其他油茶品种，只有两层栅栏层，栅栏组织细胞为较细长的长柱形，排列紧密；而其他油茶品种均有三层栅栏层细胞，其与海绵组织相邻的栅栏组织层的排列均较疏松。鄂油54号的栅栏层细胞呈较粗短的圆柱形，其排列较紧密；赣州油8号的栅栏层细胞为较粗短的圆柱形，排列紧密；长林4号的栅栏层细胞为较细的长柱形，排列紧密；鄂油102号的栅栏层细胞为较粗短的圆柱形，排列紧密；大别山1号的栅栏层细胞呈呈较细的长柱形，排列紧密。一般而言，从图1中也可看出，细长类的栅栏层细胞较粗短型的排列更整齐紧密。栅栏层细胞排列越紧密，表明其耐寒性越强。

由表1可知，6个油茶品种间叶片组织结构的差异明显，其栅栏组织厚度为129.77～171.10 μm，海绵组织厚度为164.15～208.65 μm，栅海比为 0.71～0.95，细胞组织紧密度为37.41～43.06，细胞组织疏松度为45.12～52.41。综合比较后发现，6个油茶品种中，大别山1号的栅栏组织层厚度、栅海比及细胞组织紧密度数值均为最大值，表明大别山1号的叶片结构较其他品种更为紧密；而鄂油54号和岑软3号的海绵组织厚度与细胞组织疏松度数值均较大，表明这两个品种的叶片结构均较疏松。

2.2 不同品种油茶耐寒性的综合评价

为了确立最佳评价方案，对6个油茶品种叶片的9项解剖结构指标标准化后进行聚类分析，结果如图3所示。由图3可知，9项叶片解剖结构指标可聚集为4类：第1类包括叶片厚度、栅栏组织厚 度、组织结构紧密度、下表皮厚度；第2类包括上表皮厚度、栅海比；第3类包括组织结构疏松度、海绵组织厚度；第4类包括气孔密度。此时各类别指标间有较为明显的距离，其相关性较小。根据相关指数的大小确定各类指标中的典型指标，相关指数的计算公式为：Ri2=Σr2/(n-1)。式中：Ri2为每类别指标的相关指数；i为某类指标，i=1,2,…n，n为每类指标的个数；r为同类指标中各相关指标间的相关系数。叶片解剖结构指标的相关矩阵见表2，指标间的相关系数反映了各指标间的相互影响关系。在同一类别指标中，相关指数最大的指标即为该类指标中的典型指标，若相关指数相等，同类指标中各指标变异系数的大小即可反映该指标的差异性，因而选取变异系数最大的指标作为典型指标。根据相关系数计算出的4个类别指标的相关指数，然后根据相关指数大小对其进行排序，结果见表3。由表3可知，4类指标中的典型指标分别为：第1类为组织结构紧密度；第2类为上表皮厚度；第3为海绵组织厚度；第4类为气孔密度。

图3 9项叶片解剖结构指标的聚类分析结果Fig.3 Cluster analysis result of nine leaf anatomic structure indexes

根据筛选出的与各个油茶品种耐寒性密切相关的4项叶片解剖结构指标（上表皮厚度、海绵组织厚度、组织结构紧密度、气孔密度），应用隶属函数法对6个油茶品种的耐寒性进行综合评价，结果见表4。由表4可知，6个油茶品种的耐寒性由强到弱依次为：大别山1号＞鄂油102号＞赣州油8号＞长林4号＞岑软3号＞鄂油54号。

表2 叶片解剖结构指标的相关矩阵†Table 2 Correlative matrix of leaf anatomic structure indexes

表3 4类叶片结构指标的相关指数及排序Table 3 Correlation indexes and ranking of four categories of leaf structure indexes

表4 6个油茶品种耐寒性的综合评价结果Table 4 Comprehensive evaluation result of cold tolerance in six C.oleifera cultivars

3 结论与讨论

3.1 结 论

3.1.1 表皮结构特征与油茶耐寒性的关系

表皮是植物的保护组织，是植物抵御外界不良环境的屏障，叶片表皮厚可以减轻低温等对叶片内部组织的伤害[12-13]。气孔是叶片内部组织与外界环境之间进行气体交换及植物水分散失的主要通道，气孔数量多，呼吸效率高，生长速率快，水分散失量也大[14]，因此，一般认为，叶片气孔密度小的植物其耐寒性强[15-17]。本研究结果表明，不同品种油茶的耐寒性与其上表皮厚度的大小顺序较为一致，而与其气孔密度的排序差异较大。这一研究结果说明，在评价油茶耐寒性时，不能以单项指标作为评价标准。

3.1.2 叶肉结构特征与油茶耐寒性的关系

有关研究结果表明，植物叶片结构可以反映植物的耐寒性，栅栏组织排列紧密且厚度越大则其耐寒性越好，而海绵组织排列疏松且厚度越大则不利于植物耐寒[18-19]。环境变化可导致叶片组织结构的改变，且不仅仅是单一结构发生改变，因而也要综合比较叶片组织结构间存在相互制约关系的结构指标（紧密度、疏松度、栅海比）。也有研究结果表明，植物的耐寒性与叶片结构紧密度和栅海比均呈正相关，而与结构疏松度呈负相关[21-24]。研究中发现，在6个油茶品种叶片的解剖结构中，大别山1号的组织结构紧密度最大，这与其耐寒性评价结果的最大值一致；鄂油54号的海绵组织最厚，这与其耐寒性评价结果的最小值一致；而其他油茶品种组织结构紧密度的排序及其海绵组织厚度的排序与其耐寒性的排序均有差异，说明在评价油茶耐寒性时不能仅仅以组织结构紧密度或海绵组织厚度此类指标中的某一单项指标作为评价标准，应当考虑多项指标进行综合评价。

3.2 讨 论

本研究应用变异系数分析了各个油茶树种叶片各项结构指标的稳定性，并用相关分析法和聚类分析法对叶片组织结构指标进行了归类筛选，再用筛选出的典型指标对6个油茶品种的耐寒性进行了初步评价。结果表明，耐寒性是叶片多项结构指标相互作用的结果，若单独以某项指标来分析，不同油茶品种的耐寒性的排序则各有不同，因此，必须采用多项结构指标进行综合比较和分析。本研究采用隶属函数法对6个油茶品种的耐寒性进行了综合评价，结果显示，大别山1号的耐寒性最强，其次依次是鄂油102号、赣州油8号、长林4号和岑软3号，鄂油54号的耐寒性最弱。油茶耐寒性不仅受其遗传、自身结构的影响，同时与外界环境相关。鄂州油茶品种系列的耐寒性，其种间差异的存在引起其耐寒性差异的出现，后续研究应从分子水平上进一步探索油茶抗寒机理。此外，有关研究结果表明，同一座山上不同生态区域间海拔越高、温度越低的野生油茶品种其抗寒性越强[25]，而且，将来自不同地区的油茶品种引种栽培到气候相近的地方后其耐寒性的表现也不同，说明其耐寒性仍受种源地的影响[26]。本研究仅从不同油茶品种叶片结构方面分析其耐寒性，没有与油茶生长相关的其他生理指标结合起来分析，因而存在一定的局限性。后续研究应进一步调查统计低温时期油茶的生长状况，并结合油茶的生理反应指标进行测定分析，采集连续多年的相关数据进行油茶耐寒性评价，以得到更加准确的评价结果。