石 浩，王仁才，王 琰，何小娥，周 倩，卜范文

（1.湖南农业大学 a.园艺学院；b.植物保护学院；c.东方科技学院，湖南 长沙 410128；2.湖南应用技术学院 农林科技学院，湖南 常德 415100；3.湖南省园艺研究所，湖南 长沙 410125）

猕猴桃Actinidia chinensis被誉为“水果之王”，因其果实具有较为独特的营养价值、药用价值和较高的经济价值而颇受人们的喜爱[1]。近年来，猕猴桃产业飞速发展，已成为当今国内外竞相发展的新兴高效高档水果[2]。湖南全省的猕猴桃栽培面积达11 000 hm2，其产量达12.8万t以上，已成为全国猕猴桃的主栽省区之一[3-4]。猕猴桃资源具有重要经济、生态和社会效益，但其果实不耐贮运的特性已成为其产业发展的制约因子[5]。猕猴桃果实采后易受真菌感染，从而极易软化腐烂[6]。目前，许多研究者在软腐的猕猴桃果实中鉴定出了青霉菌penicillum italicum、葡萄孢菌Botrytis cinerea、间座壳菌Diaporthe、葡萄座腔菌Botryosphaeia dothidea和拟茎点霉菌phomopsis sp.等致腐病原菌，这些病菌可使其果实发病率达到20%以上[1,7-10]。因此，猕猴桃果实采收后，应迅速采取有效措施以防腐保鲜。随着人们生活水平的提高及食品安全意识的增强，许多以前使用效果较好但易产生有害物质残留和使病菌产生抗药性的化学杀菌保鲜剂逐渐被淘汰甚至被禁用，因化学保鲜剂的不当使用而引起的食品安全事故的频发，使得人们对食品安全的诉求与日俱增，因此人们更加关注天然保鲜剂的研究与开发[11-13]。近年来的研究结果表明，植物有效成分在天然保鲜剂的开发和应用中具有独特的优势和广阔的前景。韩永萍等[14]研究发现，茶油复合物对樱桃具有较好的保鲜效果；史振霞等[15]研究发现，黄连、丁香、桂皮复合中草药提取剂对鸭梨具有较好的保鲜效果。利用天然植物提取物对产品进行贮藏防腐保鲜处理，这在许多园艺产品的贮藏保鲜研究方面已有报道，但有关天然植物提取物在猕猴桃鲜果保鲜中的应用的研究报道却较少。因此，以中草药提取物应用于猕猴桃果实防腐保鲜的试验研究，对于猕猴桃的绿色安全贮藏及其产业化高效生产均有十分重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物和菌种

供试植物共有120种，分别购于湖南九芝堂医药有限公司和湖南养天和大药房，部分常见植物自行采摘，药材名称及用药部位列于表1。供试菌种为葡萄座腔菌Botryosphaeia dothidea和间座壳菌Diaporthe，均由植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室课题组自行分离鉴定所得。

1.1.2 试剂与仪器

所用试剂：3%的中生菌素800倍液、20%的噻菌铜600倍液、10%的多抗霉素800倍液，均为江西禾益化工股份有限公司生产；纳他霉素，由友康恒业生物科技公司生产。葡萄糖、琼脂粉、丙酮、葡萄糖，均为中国医药（集团）上海化学试剂公司生产。

仪器设备：GZ-400-GII恒温光照培养箱，韶关市广智科技设备有限公司；DSZ2000X倒置生物显微镜，北京中显恒业仪器仪表有限公司；HVA-85灭菌锅，上海申安科技有限公司；DHG-9146A干燥箱，上海申安科技有限公司；LC-10N-50A台式冷冻干燥仪，力辰科技有限公司；PHS-25型PH计，上海仪电控股（集团）公司。

表1 供试植物名称及用药部位Table 1 Name and application positions of tested plants

1.2 试验方法

1.2.1 植物提取液的制备

将上述植物样本经烘干后打粉过100目筛。取10 g植物粉末置于锥形瓶中，同时移取50 mL丙酮置于锥形瓶中，用保鲜膜封口，以150 r/min的转速室温振荡12 h后，超声提取0.5 h，抽滤得滤液，采用旋转蒸发仪浓缩滤液至10 mL以下后用10 mL的容量瓶定容，得到1.0 g/mL的提取液，于4 ℃条件下冷藏以备用。另取部分肉桂、黄芩、丁香提取液浓缩干燥至粉末，于4 ℃条件下冷藏以备用。

1.2.2 菌液的制备

取直径约5 cm、已活化的菌块接种于土豆培养基上，再将其放在培养箱中，在28 ℃条件下避光培养1周后，取新生长菌落置于离心管中，然后在离心管中加入1 mL 2%的吐温80和3 mL 0.9%的生理盐水。用玻璃棒搅拌打碎，将菌孢子悬浮液控制在105～106cfu/mL，于4 ℃条件下保藏以备用。

1.2.3 提取液抑菌活性的测定

采用牛津杯法测菌抑制率[16]。在PDA培养基上加入0.5 mL的菌悬浮液，用小毛刷涂匀。取3个 牛津杯等距插入培养皿中，移取200 µL植物提取液（0.22 µm机膜过滤）于牛津杯中。在28 ℃条件下避光培养96 h后测定抑菌圈的直径。以丙酮作为空白对照，同时以3%的中生菌素800倍液、20%的噻菌铜600倍液、10%的多抗霉素800倍液、80 µg/mL的纳他霉素作为阳性对照。

1.2.4 最低抑菌浓度的测定

制备含有浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/mL的提取物的PDA培养基，取0.3 mL的上述孢子悬浮液于培养基上，用小毛刷涂匀。在28 ℃的培养基中避光培养，观察病原菌的生长状况。

1.2.5 最低杀菌浓度的测定

制备含有浓度分别为62.5、125、250、500 mg/mL的提取物的PDA培养基后，按照1.2.4中说明的方法进行试验，观察病原菌的生长状况。

1.2.6 黄芩、肉桂、丁香提取物对菌丝生长量的影响试验

由于肉桂、丁香提取物具有非常强的抑菌效果，黄芩也具有较强的抑菌效果，同时它们分别含有大量的挥发油类和黄酮类物质，为给后期复配物的抑菌试验打下基础，故而对这3种植物提取物进一步进行了抑菌验证试验。取PDA液体培养基30 mL置入锥形瓶中，加入孢子悬浮液1 mL，在28 ℃的条件下振荡培养，待长出菌丝球后再加入最终浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的黄芩、肉桂、丁香提取物，继续培养5 d，将菌丝体过滤后干燥处理并称重，重复3次。

1.2.7 黄芩、肉桂、丁香提取物对猕猴桃果实发病率的影响试验

取健康猕猴桃果实，用接种针戳出2～3 mm的孔，每个果实戳孔5个。配置浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的提取液（含混合孢子106个/mL），取上述提取液10 μL涂于果实戳孔处。在温度为28 ℃、相对湿度为90%的条件下贮藏1周。统计各处理果实的发病率。

每组发病率(%)=(每组发病的伤口数/每组发病的总伤口数)×100。

2 结果与分析

2.1 植物提取液对菌体的抑制效果

丁香、肉桂、零陵香、黄芩、油茶饼粕、广藿香、菖蒲、迷迭香、黄连、凤仙透骨草、山苍子等植物的丙酮提取液具有较强的抑菌效果，其抑菌效果见表2。由表2可知，其抑菌圈的直径均在15 mm以上，可能因为这些植物的提取液中具有较多的芳香油类物质和黄酮类物质，故可有效杀灭间座壳菌和葡萄座腔菌这两类真菌[17]。同时，细辛、葡萄籽、川芎、苦楝、毛蕨、苦参、海金沙、大黄、麻黄根、孜然、皂角刺、荆芥、独活、杜仲、五加皮等植物丙酮提取液的抑菌效果也都较好，其抑菌圈直径均在10 mm 以上，可能因为这些植物的提取液中含有较多的生物碱、醌类、多酚、皂苷类物质，从而能有效杀灭或抑制这两种真菌[18]。

2.2 植物提取液对菌体的最低抑制和杀灭浓度

不同植物的丙酮提取液对葡萄座腔菌和间座壳菌的最低抑菌和杀菌浓度见表3。由表3可知，丁香和肉桂的抑菌效果最好，最低抑菌浓度非常低，仅为3.125 mg/mL；其次分别为广藿香、细辛、黄 苓、荆芥、迷迭香、零陵香等物种，其最低抑菌浓度在10.00 mg/mL左右。这一结果表明了上述植物对葡萄座腔菌和间座壳菌均有较强的抑制作用。各种植物的最低杀菌浓度都比较高，而抑菌效果相对最好的丁香、肉桂等植物的提取液其杀菌浓度都达到了62.5 mg/mL，这可能因为植物中有效成分的单位含量较低或植物粗提物的抑菌效果不佳[19]。

2.3 黄芩、肉桂、丁香提取物对间座壳菌和葡萄座腔菌菌丝生长量的影响

2.3.1 黄芩、肉桂、丁香提取物对间座壳菌菌丝生长量的影响

黄芩、肉桂、丁香这3种植物的提取物对间座壳菌菌丝生长量的影响情况如图1所示。由图1可知，空白对照组的真菌在培养5 d后其菌丝的干质量为0.82 mg，在培养液中加入不同浓度的植物提取物后，菌丝生长量有所降低，且随着提取物浓度的逐渐升高，菌丝生长的抑制现象越明显。当提取物的质量浓度为0.1 mg/mL时，丁香、肉桂提取物处理组的菌丝干质量相比于黄芩提取物处理组的菌丝干质量（0.79 mg）均减少了10.50%以上。当提取物的浓度为1.5 mg/mL时，丁香、肉桂提取物处理组的菌丝干质量仅分别为0.11、0.10 mg。当植物提取物的处理浓度达到2.0 mg/mL时，以这3种植物提取物处理的菌丝干质量均在0.05 mg以下。

表2 不同植物丙酮提取液对葡萄座腔菌和间座壳菌的抑菌效果（96 h）Table 2 Inhibitory effects of plant acetone extracts on B.dothidea and Diaporthe (96 h)

表3 不同植物的丙酮提取液对葡萄座腔菌和间座壳菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度Table 3 Minimum inhibitory concentrations and minimum bactericidal concentrations of plant acetone extracts on B.dothidea and Diaporthe mg/mL

2.3.2 黄芩、肉桂、丁香提取物对葡萄座腔菌菌丝生长量的影响

黄芩、肉桂、丁香这3种植物的提取物对葡萄座腔菌菌丝生长量的影响情况如图2所示。由图2可知，空白对照组的真菌在培养5 d后其菌丝的干质量为1.19 mg，随着浓度的增加，提取物对菌丝生长的抑制能力逐渐增强，当3种植物提取物的处理浓度为1.0 mg/mL时，其抑菌效果均不佳，菌丝的干质量均仍在0.77 mg以上。当其处理浓度达到1.5 mg/mL及以上时，相比于空白组，3种植物的提取物对菌丝生长量的影响均有较好的抑制效果，此时黄芩、丁香、肉桂提取物处理组的菌丝干质量分别仅为0.48、0.33、0.28 mg。而当其提取物的浓度达到2.0 mg/mL时，菌丝的干质量均非常低，均已低于0.1 mg以下。

图1 不同浓度的植物提取物对间座壳菌生长量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of plant extracts on increment of Diaporthe

图2 不同浓度的植物提取物对葡萄座腔菌生长量的影响Fig.2 Effects of different concentrations of plant extracts on increment of B.dothidea

2.4 黄芩、肉桂、丁香提取物对猕猴桃果实软腐病发病率的影响

将供试的猕猴桃果实经接种菌种后置于培养箱中培养7 d，其果实的发病率如图3所示。由图3可知，空白对照组的果实发病率最高，达到了86%；随着植物提取物浓度的增加，猕猴桃果实软腐病的发病率呈下降趋势，当黄芩、肉桂、丁香提取物的浓度达到1.0 mg/mL及以上时，猕猴桃果实的发病率明显降低，此3种植物提取物处理组的果实发病率均减少了25%以上。当提取物的浓度增加到2.0 mg/mL时，此3种植物提取物处理组的果实发病率与对照之间相差37%左右，这一结果表明，此3种植物的提取物均可有效降低猕猴桃果实的发病率。

图3 不同浓度的植物提取物对接种果实发病率的影响Fig.3 Effects of different concentrations of plant extracts on incidences of inoculated fruits

3 讨论与结论

猕猴桃果实软腐常表现为生理自然软化，也有由真菌感染所致的胁迫被动软化的，防治猕猴桃快速软腐的方法有很多种，其中最常用的方法是化学处理法，但化学处理常伴随着试剂残留，不利于果实的绿色贮藏，本研究采用120种中药材提取物进行猕猴桃软腐病菌（葡萄座腔菌、间座壳菌）的抑菌筛选试验，结果表明，不同植物提取物的抑菌效果具有较大的差别，有些植物具有抑菌效果，而有些植物不具有抑菌效果，有些植物的抑菌效果好，而有些植物的抑菌效果差，还有些植物提取液对不同真菌的抑菌效果具有一定的选择性，如乌蕨、苦楝、博落回、橘红、樟树叶等植物提取液并不会同时抑制两种真菌。丁香、肉桂、零陵香、黄芩、油茶饼粕、广藿香、菖蒲、迷迭香、黄连、凤仙透骨草、山苍子等植物提取物的抑菌效果均较好，而其对此两种真菌的抑菌圈直径均可达15 mm以上，其中丁香、肉桂、广藿香、细辛、黄苓等中药提取物的抑菌效果最佳，其最低抑菌浓度均在5 mg/mL左右，其最低杀菌浓度均在100 mg/mL左右。这些植物中都含有丰富的挥发油、生物碱、黄酮类、皂苷等物质，这些有效提取物破坏了真菌的细胞结构、影响了细胞代谢和分化，从而抑制或杀灭真菌[20-22]。陆宽等[23]、曾志红等[24]研究发现，肉桂、丁香丙酮提取物含有丰富的挥发油类物质，对多种病原菌均有非常强的抑制作用，当其浓度为3.125 mg/mL 时，提取物对枝孢霉菌便具有较强的杀灭作用，这与本研究所得的结果基本一致，说明这2种植物对真菌均有一定的广谱杀菌作用。

本研究从120种中药材中筛选出抑菌效果较好的药材，并测定了不同浓度的提取物对间座壳菌和葡萄座腔菌的最低抑菌浓度与最低杀菌浓度，但其最低杀菌浓度比较高，由于中药材提取物为粗提混合物，一方面可能因为其所含有效成分较少，另一方面可能因为粗提物中有些成分会影响到活性物质的抑菌效果[25]，在后期试验中可单独对几种或某种抑菌效果好的药材提取物进行分离纯化，以准确判定其主要抑菌物质及其抑菌能力。本研究选取了肉桂、丁香、黄芩这3种中药材，并测定了其提取物对2种真菌菌丝生长量的影响情况和抑制效果，采用液体培养基培养，随着培养基中中药浓度的增加，真菌菌丝的生长量则逐渐减少，说明3种中药材对真菌的抑制能力逐渐增强，当3种中药材提取物的浓度达到2.0 mg/mL时，各处理组的间座壳菌菌丝的干质量均在0.05 mg 以下，而葡萄座腔菌菌丝的干质量均在0.1 mg以下。这一结果说明，这3种中药材均有较强的抑菌能力，且其提取物均无毒、无异味，都是较好的天然防腐抑菌剂。以此3种中药材提取物对供试的猕猴桃果实进行防腐处理，结果表明，丁香、肉桂处理组猕猴桃果实的发病率要略低于黄芩处理组，可能因为，前两者一方面具有更强的抑菌效果，另一方面前两者提取物中多为挥发油，其可有效防止果实水分蒸发枯萎。同时，3种中药材提取物处理均可明显减少果实的发病率，当其处理浓度均达2.0 mg/mL时，果实发病率均减少了35%左右。这是因为，一方面提取物杀灭了软腐菌，另一方面提取物对果实本身也有一定的防腐保鲜作用[26-27]。本研究目前仅处于试验阶段，后期的研究，应在进一步改良植物提取物的配方的基础上，将其应用于后期的猕猴桃商业化防腐处理中，以延长猕猴桃的货架期，提高其经济价值，同时后期研究还应进一步揭示其抑菌机理，以验证和弄清植物提取物作用于猕猴桃类腐生菌后真菌死亡的原因。