张春红，王小敏，闾连飞，李维林，吴文龙

（1.江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014；2.南京林业大学 林学院，江苏 南京 210037）

黑莓Rubusspp.隶属于蔷薇科Rosaceae悬钩子属Rubus，为第3代小浆果类果树的一种特色类型，其果实含有人体必需的可食纤维质、基础维生素、矿质元素及酚类物质等，受消费者青睐[1]。悬钩子果树遗传背景较为复杂，且不同倍性种质的亲和性较低，使得其常规育种工作进展较慢。SSR（simple sequence repeats）又称“简单序列重复”，是20世纪80年代发展起来的一种新型DNA标记，具有多态性丰富和共显性等显著优点，被广泛用于不同树种的品种鉴定、种质资源研究、遗传图谱构建以及标记辅助选择等[2-3]。利用已报道的SSR标记开展杂交品种系谱分析[4]、遗传连锁图谱构建和基因定位[5]以及黑莓杂交品系鉴定[6]，证实SSR引物在黑莓种质资源鉴定和育种中具有极好的应用潜力。然而，黑莓品种多由悬钩子种质高度杂合选育而来，种质遗传背景不清晰，使得种质鉴定、杂交育种、种质挖掘等具有一定难度，现有可用于分析的SSR引物也具一定的局限性。因而，有必要利用现有的生物学手段开发更多适用性好的SSR引物用于黑莓种质鉴定，这有利于了解现有种质品种遗传基础，为开展杂交组合亲本选配及辅助选择育种提供现实依据。

品种遗传多样性一方面表现在表型性状上的差异，可根据表型及生长性状进行种质遗传多样性评价[7]；另一方面，分子标记的发展为从DNA水平上检测品种及品系间的遗传多样性提供了有利工具。近年来，基于高通量测序技术开发分子标记逐渐成为一种获取特异标记位点的有效方法[8]。基于转录组测序发掘的EST-SSR标记作为共显性标记具有特异性和多态性好等诸多优点，可有效用于物种鉴定和遗传多样性分析[9]。EST-SSR标记作为编码序列的一部分，基于基因编码区开发，能够作为某些性状或者基因的直接功能基因标记。本研究中基于课题组前期黑莓转录组测序数据，搜索分析其中EST-SSR标记，对具有应用潜力的标记进行验证和开发，旨在利用多态性好的标记进行现有黑莓品种间遗传多样性分析，为检验EST-SSR标记的可行性及黑莓杂交组合配制亲本选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为课题组从国外引进的18份黑莓品种，种植于江苏南京溧水白马科学基地，其名称、育种原地和系谱等信息见表1。于旺盛生长期采集各黑莓品种幼嫩叶片，置于-80 ℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取

参照文献[10]，采用CTAB法提取黑莓基因组DNA。用0.8%琼脂糖凝胶电泳法检测其质量，将DNA质量浓度稀释至50 ng/μL后，置于-20 ℃ 保存备用。

1.2.2 SSR序列的筛查与鉴定

EST-SSR序列来源于前期黑莓品种‘Boysenberry’转录组测序结果[11]。利用MISA工具筛查SSR序列，根据测序结果分析ESTSSR序列（≥20 bp），进一步选取其中部分序列用于黑莓品种遗传多样性分析。筛查标准为SSR位点侧翼序列长度不小于50 bp，2、3、4、5和6核苷酸的最小重复次数分别为10、7、5、5、5次，EST序列长度大于100 bp。共初步筛查到127个符合要求的SSR序列，分别将其编号为Rh1～Rh127。

1.2.3 SSR引物的设计与合成

根据上述检测到的序列和位点，使用Primer 3设计SSR引物。引物设计标准：引物序列中无SSR；序列在DNA保守序列区内；长度18～24 bp；上下游引物不存在互补序列；引物自身不存在互补序列；引物退火温度50～65 ℃；上下游引物的退火温度差值不大于5 ℃；GC含量40%～60%；产物大小为100～400 bp。筛选到的2～6核苷酸重复基序的127对EST-SSR引物（Rh1～Rh127），由上海捷瑞生物工程有限公司合成，用于后续引物筛选和品种鉴定。

1.2.4 SSR引物的扩增筛选

利用上述EST-SSR引物，扩增黑莓的基因组DNA。PCR扩增反应体系的总体积为20 μL，其中包括1 μL 50 ng模板DNA、10 μL 2×Taq PCR Master Mix（含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液）、10 μmol/L的上游和下游引物各1 μL，7 μL的ddH2O。PCR反 应 程 序：94 ℃预变性 5 min，然后进行30个扩增循环，每个循环包括94 ℃变性30 s，复性（45～60 ℃）30 s，72 ℃延伸 30 s，循环结束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增反应在ABI Veriti96 PCR仪上进行。

表1 18个黑莓品种的名称、系谱和原产地Table 1 Names, parentages and breeding locations of 18 Rubus spp.cultivars

反应结束后，产物加入2 μL 6×loading buffer，以50 bp DNA Ladder为DNA相对分子质量标准，采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，150 V稳压电泳120 min，以蓝色条带跑至距聚丙烯凝胶底部1/3左右为宜。电泳结束后，用0.2%AgNO3染色和拍照。利用筛选出的多态性好的SSR引物对各种质资源的黑莓基因组总DNA样品进行PCR扩增，根据条带扩增情况统计稳定扩增出清晰目的条带的引物。

1.2.5 SSR引物在黑莓品种遗传多样性分析中的应用

用上述筛选得到的127对引物进行SSR扩增，随机选择品种模板用于引物及最适退火温度的筛选，各引物对应的最适退火温度通过梯度PCR试验确定。记录每个样品每对引物的DNA扩增带型，将多态性稳定的引物的扩增结果拍照。将其条带大小与相对分子质量标准进行比对记载，将有条带标记为“1”，无法正确辨别带型以“0”表示。根据DNA扩增带型区分鉴定黑莓品种，带型数据用于后续遗传多样性分析。通过分析EST-SSR结果，比较品种间多态性位点的差异，确定引物的多态率和多态信息量。使用NTSYS-pc Ver.2.10e软件进行基于UPGMA法的聚类分析，使用Picalc 0.6软件计算各引物的位点多态性信息含量（PIC）值。

2 结果与分析

2.1 SSR引物多态性扩增产物的筛选

将127对SSR引物进行扩增，筛选引物适合温度并检测目的条带情况，发现除Rh15和Rh127外其余125对引物均可扩增出条带。将125对引物用于18个品种的扩增鉴别，发现有特异条带且大小符合预期的引物共50对。50对引物中有多态引物为45对（表2），占引物数的36%，进一步将45对引物用于黑莓品种种质的遗传多样性分析。

2.2 多态性引物扩增产物的多态性

45对多态性引物中，多数引物扩增的位点数为2～5。用45对多态性引物在18份材料中共检测到191个等位基因变异，平均每个SSR位点有4.24个，变幅为2～8个。位点PIC为0.427～0.893，平均0.692。基本可有效检测出不同品种间材料的SSR差异位点，具有较高的遗传多样性代表性。

根据45对条带清晰、多态性好、稳定性好、便于统计的引物扩增结果，利用UPGMA对18份不同类型的材料进行聚类分析（图1）。从聚类群中可以看出，18份材料可被明显分为3个大类群，从上至下分别包括7、8和3个品种，分别记为第1、第2和第3类群。第1类群中，除Brazos产地为德克萨斯州外，其余均由阿肯色州立大学选育。第2类群中8个品种均由美国农业部推选，第3类群中3个品种产地来源不同，Boysenberry和Youngberry均为七倍体，Black Butte为六倍体。

表2 黑莓多态性EST-SSR引物序列及多态性检测结果Table 2 Polymorphic EST-SSR primer sequences from Rubus spp.and ploymorphism detection result

45对引物中，多态性较好的引物有Rh121，检测到8个等位基因，其次是Rh114和Rh118，均可检测到7个等位基因，有7对SSR引物（Rh37、Rh40、Rh74、Rh100、Rh103、Rh111、Rh115）可检测到6个等位基因，另有7对引物检测到5个等位基因。Rh72、Rh100、Rh118、Rh121分别可检测到5、6、7、8个等位基因，扩增结果如图2所示，这些引物扩增产物条带清晰，或易于区分18份材料，因此具有较好的应用价值。

图1 基于遗传相似系数的18个黑莓品种的聚类分析Fig.1 Cluster analysis result of 18 Rubus spp.cultivars based on genetic similarity coefficients

图2 4对多态性好的SSR引物对18个黑莓品种基因组DNA的扩增图谱Fig.2 Amplification maps of genomic DNA from 18 Rubus spp.cultivars by using four polymorphic EST-SSR primers

3 结论与讨论

自1986年由江苏省中国科学院植物研究所引入国内以来，黑莓在生产上表现出良好的潜力，但其遗传背景复杂且种间亲和性低等因素使得育种进展缓慢。将SSR标记用于不同物种品种鉴定及遗传多样性分析上的研究已有大量报道，但应用于悬钩子属果树黑莓开发利用的研究鲜见报道，目前仅有Lewers等[12]进行EST文库搜索和Castillo等[13]建立基因组文库开发SSR标记的报道。本课题组前期通过对1年生黑莓枝茎尖进行转录组测序，预测搜索到3 393个EST-SSR标记，发现重复位点长度在20 bp以上的1～6碱基重复的SSR数目为338条[11]。在此基础上，本研究中设计了其中不同重复基元多态性潜能高的127对SSR引物，扩增黑莓基因组DNA后，发现仅2对无扩增产物，表明所设计引物具有良好的扩增效果。125对引物中有45对呈现多态性，利用这些引物对18份黑莓品种样品进行遗传多样性检测，结果表明这些引物多态性信息含量丰富，可进一步用于悬钩子果树黑莓品种杂交鉴定、指纹图谱构建等育种研究。

本研究中所用的引进黑莓品种主要来源于美国俄勒冈州和阿肯色州的两大黑莓育种中心，且多为四倍体[14]。从系谱分析和育成地点来看，供试材料中有6个引进品种均由美国阿肯色州立大学黑莓育种试验站选育（表1），在聚类分析中明显聚在一起，可能与其亲本来源种质成分具一定相似之处有关。如Natchez品种虽选自Clarksville，但因系谱中含Arapaho品种成分而与Arapaho距离较近。Brazos由马里兰大学选育，但Natchez[15]、Arapaho[16]、Choctaw、Shawnee、Comanche系谱中均有Brazos成分，因而Brazos距离这些品种较近。另一四倍体黑莓类群中，已知产地的品种均来自美国农业部俄勒冈州，尽管有些系谱来源不详，根据其较近的亲缘关系聚类结果推测，相似产地的品种可能具有某些相似遗传种质成分。此外，Hull和Chester均由美国马里兰州Beltsville试验中心选育，其系谱近似（表1），但根据扩增结果发现其带型有一定差距，表明其遗传背景有一定差异，这与2个品种植株的田间表现差异较大也基本一致，一定程度上反映了黑莓杂交重组中的复杂性[6]。3个多倍体黑莓品种六倍体Black Butte[17]、七倍体的Boysenberry和Youngberry[18]距离较近，可能一定程度上与其复杂但相似的遗传种质成分有关。

随着分子生物学和基因组学技术的发展，越来越多的标记类型被开发和应用，目前已有基于SSR和EST-SSR标记的四倍体黑莓连锁图谱的报道[5]，SSR标记在遗传背景复杂的黑莓遗传分析中的应用展现出广泛的前景。本研究中基于转录组测序筛选出多态性较好的45对EST-SSR引物，其可应用于分析现有黑莓品种种质的遗传多样性，且发现目前引种黑莓种质遗传基础相对较窄。本研究中仅对目前江苏地区栽植的主要黑莓引种品种进行了评价，所用的EST-SSR引物也仅来自于1年生营养茎尖测序结果，因此须开发和挖掘更多的EST-SSR和SSR标记进行综合深入评价。在下一步的黑莓育种工作中，将从引进更多来源地黑莓种质资源、挖掘国内悬钩子属野生种质资源以及利用多种育种方法创制黑莓种质资源等方面开展研究。