张馨月 岳晓洁 李铮峥 刘 倩 黄 茜 马美湖 付 星

（华中农业大学食品科技学院 国家蛋品加工技术研究分中心 武汉 430070）

壳聚糖酶（EC 3.2.1.132）是一种催化壳聚糖中氨基葡萄糖之间β-1，4-糖苷键，并水解释放壳寡糖的糖基水解酶[1]。由于壳寡糖有比壳聚糖更高效的抗菌、抗氧化、降血脂、降血压、预防感染，控制关节炎以及增强抗肿瘤作用[2]，壳聚糖酶的降解作用广泛应用于农业、食品和生物医药等领域[3]。

壳聚糖酶主要来自于细菌，有关真菌壳聚糖酶的研究报道相对较少。与细菌酶相比，真菌酶具有高效性和相容性，成本低，适于工业化生产，如酶蛋白的稳定性、广泛的多样性及菌丝体易分离等[4-5]。真菌壳聚糖酶不仅可制备具有生物活性的壳寡糖和真菌原生质体，还可作为针对病原真菌和昆虫的有效生物防治剂，或者应用于生物废物的转化[1]，有较高的经济价值[6]。针对真菌壳聚糖酶的研究，目前主要集中在曲霉属[7-8]、木霉属[9-10]、青霉属[11-13]、毛霉属[14]等，有必要在菌株筛选遗传改良做进一步深入探索[1]。

菌株发酵产酶可分为液体发酵和固态发酵，普遍采用液体培养基。固态发酵是指微生物在固体物质上生长的发酵过程，微生物生长所需的水分以固体基质吸附状态存在[15]。固态发酵可以使用廉价的农业工业残留物，如麦麸、虾副产品等[1，16]。采用固态发酵更利于霉菌生产高效价的微生物胞外酶，并且被认为是一种经济有效的液体深层发酵替代方法。如闵伟红等[17]经过优化固体发酵条件，使诱变后的枯青霉产纤溶酶总酶活提高1.32倍。另外Silva 等[9]报道了哈茨木霉（T.harzianum）、康宁木霉（T.koningii）、绿色木霉（T.viride）和多孢木霉（T.polyporum）通过固态发酵产壳聚糖酶，并且从温度和pH 值对发酵条件进行优化。淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）是一种在土壤和植被中发现的真菌，较为新颖，于2012 年被Johny等[18]报道。因其有利于防治植物寄生线虫，故作为生防菌大范围应用[19]。Chao 等[20]利用淡紫紫孢菌，采用液体摇床发酵分离纯化出D-氨基葡萄糖苷酶（外切型），可促进95%的脱乙酰壳聚糖从其非还原端水解并释放氨基葡萄糖（GlcN），同时利用电喷雾电离质谱分析其水解模式。目前，尚没有关于优化淡紫紫孢菌固体发酵产壳聚糖酶条件的研究报道。本研究旨在筛选出一株新颖、传代稳定及产壳聚糖酶活力高的真菌菌株，利用单因素和响应面设计优化菌株固体发酵产壳聚糖酶条件，为促进壳聚糖酶工业生产和应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土样来自于中国杭州、邯郸、武汉等地；壳聚糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白胨，北京双旋微生物培养基制品厂；酵母浸粉，安琪酵母股份有限公司；琼脂粉，德国Biofroxx 公司；麸皮和豆粕，武汉当地市场；乙二醇壳聚糖、荧光增白剂28、SDS-PAGE 凝胶试剂盒，美国Sigma 公司；其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

752N 紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Model 5414 高速冷冻离心机，美国Beckman 公司；SW-CJ-2D 超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；SPX-250BS-II 生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；DYY-III2稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂；DF-101S 磁力搅拌水浴锅，武汉科尔仪器设备有限公司；TG16-II 离心机，湖南平凡科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基组成 初筛平板培养基（g/L）：胶体壳聚糖5，KH2PO40.7，K2HPO40.3，蛋白胨2.5，酵母粉 2.5，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01；琼脂20；自然pH 值。

液体发酵培养基（g/L）：胶体壳聚糖 5，KH2PO40.7，K2HPO40.3，蛋白胨2.5，酵母粉2.5，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01；自然pH 值。装液量为50 mL/250 mL。

固体发酵培养基：固体基质12 g，其中麸皮、豆粕各6 g，置于250 mL 锥形瓶，加入20 mL 甲液和10 mL 乙液。甲液（g/L）：胶体壳聚糖10（pH 6.0）。乙液（g/L）：KH2PO41.4，K2HPO40.6，蛋白胨5，酵母粉 5，NaCl 10，MgSO4·7H2O 1.0，FeSO4·7H2O 0.02；自然pH 值。

粗酶液制备：无菌水稀释产壳聚糖酶菌株为菌悬液，适量接种到固体发酵培养基，置于37 ℃培养4 d。培养完全加入pH 5.6 醋酸缓冲液150 mL，于4 ℃条件下磁力搅拌4 h。过滤后，将滤液4 ℃下10 000 r/min 离心10 min，收集上清液，4 ℃冰箱内保存备用。

1.3.2 菌株筛选及鉴定 灭菌的生理盐水按照不同梯度稀释土样，涂布于初筛平板培养基，37 ℃下培养3～6 d。随后，对有明显透明圈的单个菌落开展划线纯化培养。测量菌落直径d 和透明圈直径D，以D/d 值作为衡量产壳聚糖酶能力的初筛标准。初筛的菌株液体发酵培养，37 ℃，4 d，通过DNS 法测定产酶活力高的菌株。

按照分子生物学操作手册提取目标菌株的DNA，利用真菌18S rDNA 通用引物进行PCR 扩增，扩增结果委托华大基因测序，将其具体测序结果与NCBI 数据库进行基因比对。根据比对结果，在ClustalX 和MEGA 软件的辅助下构建菌株系统发育树。

采用插片法培养该真菌，乳酸石炭酸棉蓝染料染色15 min 制片，高倍镜下观察该菌株形态学。

1.3.3 壳聚糖酶活力及蛋白质含量测定 采用DNS 法测还原糖的原理测定壳聚糖酶活力，取450 μL 胶体壳聚糖溶液（10 g/L）和400 μL 醋酸缓冲液（pH 5.6）于2 mL 离心管中，50 ℃水浴锅中提前预热30 min，再向离心管中加入150 μL 粗酶液。于50 ℃中恒温反应30 min，迅速加入750 μL DNS 终止反应，涡旋仪振荡均匀，沸水浴中显色5 min。待反应体系冷却后，12 000 r/min 离心10 min。取上清液于在540 nm 处测定吸光值。酶活力单位（U）定义：在上述反应条件下，每分钟释放1 μmol 氨基葡萄糖所需要的酶量。蛋白质定量主要参考Lowry 法[21]，使用牛血清蛋白制作标准曲线。

1.3.4 产壳聚糖酶固体发酵条件的单因素优化 因目标菌株M7a 液体发酵产壳聚糖酶的酶活力较低，为提高其壳聚糖酶活力，以及结合霉菌的发酵产酶特性，故采用固体发酵并优化其固体发酵条件。单因素优化包括碳源、氮源、初始pH 值、发酵温度、麸皮豆粕质量比及发酵时间。选择10 g/L 粉末壳聚糖、胶体壳聚糖、几丁质粉末、胶体几丁质、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠以及在10 g/L 胶体壳聚糖基础上添加5 g/L 葡萄糖和蔗糖为碳源，通过添加不同碳源，观察对目标菌株发酵产酶的影响。在最佳碳源基础上，选取10 g/L 蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、硫酸铵、硝酸铵、尿素为氮源，进一步确定最佳氮源。在最适碳源和氮源的条件下，梯度改变固体发酵培养基（乙液）起始pH（4.0～9.0）和培养温度（27～52 ℃，5 ℃为梯度），确定最佳初始pH 值和发酵温度。然后改变培养基中豆粕麸皮的比例，观察对菌株产壳聚糖酶的影响。最后，在以上单因素最优条件下培养，在0～8 d 连续观察菌株M7a 产蛋白质和壳聚糖酶活力，确定最佳发酵时间。

1.3.5 产壳聚糖酶固体发酵条件的响应面优化在单因素试验基础上，对固体发酵产壳聚糖酶条件进一步优化，开展基于Box-Behnken 设计的3因素3 水平响应面试验，结果见下表1。

表1 响应面分析的因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.6 SDS-PAGE 及酶谱分析 SDS-PAGE 电泳采用浓度为12%的分离胶和浓度为5%的浓缩胶。电泳后固定液固定30 min，考马斯亮蓝R-250 染色30 min，水洗后利用Gel-Pro analyzer 软件分析蛋白质的分子质量。壳聚糖酶的酶谱分析，于电泳分离胶中加入溶解完全的乙二醇壳聚糖，使其在分离胶中的质量浓度保持在100 mg/L。电泳结束后，分离胶用10 mL/L Triton X-100 复性剂振荡复性36 h。然后，用荧光染料染色5 min，水洗1 h，将电泳胶置于紫外灯下观察，所在位置的条带显示为暗带表明具有壳聚糖酶活性。

1.3.7 数据分析 采用 Excel 2010、OriginPro 2017C 64Bit 及Design-Expert8.0.6 软件进行分析做图，试验中各发酵条件的优化均做3 次平行，结果取3 次结果的均值，并计算相对标准误差及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 产壳聚糖酶菌株的筛选及鉴定

通过初筛培养基，从土样中筛选出有明显透明圈且能够高产壳聚糖酶的菌株。其中菌株M7a产壳聚糖酶活性较高，透明圈与菌落直径比（D/d）为4.8，初始酶活力达到3.29 U/mL，且传代产酶较为稳定，因此将M7a 作为目标菌株。图1a，1b 显示M7a 菌落质地紧密，初白色圆形颗粒状，后变为淡紫羊皮状，背面淡黄色。分生孢子短而密，显微镜下孢子梗直立呈分支状，分生孢子椭圆到梭形，无厚壁孢子。进一步通过18S rDNA 分析，测序结果在NCBI 数据库中进行比对。图1c 显示菌株M7a与淡紫紫孢菌HT011（MH512954.1）同属一个分支，结合菌株形态鉴定M7a 为淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）。

2.2 单因素优化淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶

2.2.1 碳源对淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶的影响 选择粉末壳聚糖、胶体壳聚糖、几丁质粉末、胶体几丁质、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、CMC 进行菌株产壳聚糖酶固体发酵碳源优化，试验结果如图2a。10 g/L 胶体壳聚糖+5 g/L 葡萄糖为碳源时产酶水平最高，达到9.75 U/mL，其次为10 g/L 胶体壳聚糖+5 g/L 蔗糖（9.49 U/mL）、10 g/L胶体壳聚糖（9.33 U/mL）和10 g/L 壳聚糖粉末（5.62 U/mL）。以胶体几丁质、几丁质粉末为碳源时，壳聚糖酶活力较低。而葡萄糖、蔗糖、CMC 或可溶性淀粉为碳源时，壳聚糖酶几乎没有活力。壳聚糖酶可分为诱导酶和组成酶，其中组成酶无需壳聚糖底物诱导也能产酶且主要来于植物病原真菌[22]，结果显示，淡紫紫孢菌M7a 产壳聚糖酶为诱导酶，需要壳聚糖诱导的作用。这与陈小娥等[23]的报道相似，而Nguyen 等[10]报道的Penicillium janthinellum D4 则以海螵鞘粉末为诱导碳源。虽然蔗糖和葡萄糖不诱导菌株产壳聚糖酶，但有利于菌体生长繁殖，当与胶体壳聚糖复合作为碳源时，产酶活力达到最高。另外，粉末和胶体几丁质均基本无法被菌体所同化利用[24]。

图2 碳源（a）、氮源（b）、pH 值（c）、培养温度（d）、豆粕麸皮质量比（e）对淡紫紫孢菌M7a 产壳聚糖酶的影响Fig.2 Effect of carbon sources（a），nitrogen sources（b），pH value（c），culture temperature（d）and the mass ratio of soybean meal（e）on chitosanase production by P.lilacinum M7a

2.2.2 氮源对淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶的影响 在最佳碳源的条件下，选择不同氮源优化菌株固体发酵产酶。如图2b 所示，其中蛋白胨作为氮源时酶活力达到最高（10.10 U/mL），其次为硫酸铵和酵母浸粉，硝酸铵产酶活力最低（3.46 U/mL）。结果表明，该菌株不仅可以利用有机氮产壳聚糖酶，也可以利用无机氮源，对于氮源的选择具有广谱性。而Sinha[7]报道的A.fumigatus IIT-004 则以酵母浸粉为产壳聚糖酶的氮源。

2.2.3 培养基初始pH 值对淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶的影响 培养基的初始pH 值对微生物摄取利用外界环境中的营养和分泌积累代谢物有一定的作用，调节固体发酵培养基的乙液为不同pH 值，比较不同条件下的酶活力，得出发酵培养基最优pH 值，结果如图2c 所示。该菌株产酶活力在pH 为6.0 时最高（11.09 U/mL）。当pH在5.0～8.0 之间时，pH 值对菌株发酵产壳聚糖酶的影响不大。当初始pH 值继续降低至4.0 时，与升高至9.0 相比，壳聚糖酶活力下降更显著，仅为最高酶活的14.86%。得出最佳pH 为6.0。Silva等[8]所报道的Trichoderma koningii sp.产壳聚糖酶最佳pH 为5.5，条件均偏酸性。

2.2.4 温度对淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶的影响 温度是微生物发酵的重要因素，对酶的产生、合成阶段的持续时间以及固体产物的稳定性有一定程度的影响[16]。在最佳碳源、氮源以及pH 值的条件下，观察温度对菌株固体发酵培养产酶的影响，结果如图2d 所示。淡紫紫孢菌M7a 在较广的温度范围（27～52 ℃）保持产酶能力，当发酵温度为32 ℃时酶活力达到最高，为16.33 U/mL。当温度为27 ℃或37 ℃时，菌株产壳聚糖酶能力较高，没有明显下降，分别为最高酶活的71.4%和85.9%。当培养温度达到42 ℃时，产壳聚糖酶量明显下降，为最高酶活的53.2%，酶活力损失接近一半。在一定温度范围内，微生物生长代谢速率与温度呈正相关；然而像蛋白质、核酸等作为组成生物机体的重要物质，会随着温度升高造成永久性的损坏[25]。另外，低温也会阻碍真菌生长。因此，菌株在最佳发酵温度32 ℃条件下，有良好的产酶效果。Aktuganov 等[12]报道青霉菌（Penicillium sp.）最适发酵温度为28 ℃。周念波等[26]报道芽孢杆菌（Bacillus sp.LS）最适发酵产壳聚糖酶温度为55 ℃。不同的菌株产壳聚糖酶所需的最佳培养温度有很大差异。淡紫紫孢菌M7a 的最佳固体发酵温度相对而言较温和，没有低温或高温的严格要求，更有利于工业生产。

2.2.5 豆粕麸皮质量比对淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶的影响 豆粕营养丰富，含有大量多种的蛋白质和比例平衡的氨基酸以及糖类、无机盐等，主要可以提供丰富的氮源。培养基中随着壳聚糖含量的增加而促进产酶，而麸皮的增加不利于产酶[9]。由于麸皮强吸水力[27]且能够增加介质孔隙度，同时可以提供一些营养物质，如淀粉、维生素、生物素等，因此适当添加可以满足菌株固体发酵产酶必需。充分利用豆粕麸皮作为固体培养基原料，一方面绿色环保，减少农业废弃物对环境的不良影响；另一方面，提高了菌株M7a 产壳聚糖酶的能力，促进高效产酶，降低成本。在测定的最适条件下，通过调整豆粕麸皮的质量比，优化菌株固体发酵产酶。测定结果如图2e 所示，其中酶活力在豆粕麸皮质量比为7∶5 的条件下达到最高（16.44 U/mL）。因此，7∶5 为最佳豆粕麸皮质量比。

图3 培养时间对淡紫紫孢菌M7a 产壳聚糖酶的影响Fig.3 Effect of culture time on chitosanase production by P.lilacinum M7a

2.2.6 培养时间对淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶的影响 在最佳发酵条件下，观察发酵时间对菌株产壳聚糖酶的影响，包括产壳聚糖酶活力和蛋白质含量，如图3 所示。在培养第1 天，固体发酵培养基无明显菌丝，壳聚糖酶活力和蛋白质含量很低。之后的2～3 d，开始出现白色菌丝，酶活和蛋白质含量缓慢提高。第4 天时，培养基出现大量白色菌丝，菌株的壳聚糖酶活和蛋白质含量较前1 天提高了很多，达到14.28 U/mL。菌株产壳聚糖酶活力和蛋白质含量在第5 天达到最高，为16.66 U/mL。在培养到6 d 时，壳聚糖酶活力开始下降，同时蛋白质含量也开始下降。之后的7～8 d 内，菌丝颜色由白色变暗紫褐色，酶活力和蛋白质含量接近直线下降。可能是由于随着培养时间的延长，菌体细胞开始成熟老化以及发酵培养基中营养物质损耗与代谢累积，破坏了菌体细胞产壳聚糖酶最适环境。另外，可以发现发酵过程中壳聚糖酶活力的变化同菌体胞外蛋白质含量的变化趋势相近。因此，培养5 d 为菌株产酶的最佳时间。与已报道的烟曲霉A.fumigatus IIT-004（7 d）[15]、Penicillium janthinellum D4（6 d）[10]相比，淡紫紫孢菌M7a 产酶效率更高，同时适中的发酵周期也有利于实际操作和降低成本。

2.3 响应面优化淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶

2.3.1 响应面试验结果 根据单因素优化的试验结果，选择培养温度、培养基（乙液）起始pH 值以及培养时间为自变量，菌株M7a 产壳聚糖酶活力为响应值。基于Box-Behnken 设计响应面试验，结果如表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.3.2 模型的建立及统计检验 采用回归分析法处理响应面试验结果，得出菌株M7a 固体发酵产壳聚糖酶活力（Y）对试验因素培养温度（A）、培养基（乙液）起始pH（B）、培养时间（C）的三元二次多项回归方程：Y=16.63+0.45A+0.31B+0.84C+0.18AB+0.52AC+0.20BC-1.29A2-1.23B2-0.97C2，相关系数R2=0.9656，说明回归方程拟合良好，结果科学，可以分析预测菌株M7a 固体发酵产壳聚糖酶活力。

对回归模型进行方差分析及显著性检验，从表3 可知，该模型极显著（模型的F=21.80，P=0.0003）；失拟项P=0.2515＞0.05，不显著则说试验数据与模型相符，无异常；R2Adj=0.9213，模型能够解释92.13%的响应值变化。此回归模型的一次项A、交互项AC 对菌株M7a 固体发酵产壳聚糖酶活力影响显著；一次项C、二次项A2、B2、C2对酶活力影响极显著。

2.3.3 响应面的分析 通过响应曲面图和等高图，进一步分析培养温度、培养基（乙液）起始pH值以及培养时间对淡紫紫孢菌M7a 产壳聚糖酶活力的影响，结果如图4 所示。两因素之间交互作用的强弱可以通过等高图的形状体现，其中椭圆说明两因素交互作用显著，形状为圆形则说明交互作用不显著[28]。同时，响应曲面坡度越陡，则表明两因素交互作用对菌株产酶活力影响越大[29]。温度和时间的交互作用对菌株产酶活力影响显著。另外，由图4 等高线图可知，时间对产酶酶活力影响最大，依次为温度、pH 值。综上与回归方差分析表结果一致。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance for response surface of the quadratic polynomial model

图4 各因素交互作用对淡紫紫孢菌产壳聚糖酶的影响Fig.4 The pairwise interaction of various factors on chitosanase production by P.lilacinum M7a

2.3.4 实际优化及验证试验 由软件Design-Expert8.0.6 获得最优工艺条件：培养温度32.9 ℃、培养时间5.5 d 以及培养基（乙液）起始pH 为6.1，最终酶活力达到16.95 U/mL。通过一定的实际调整，得出最佳条件为温度33 ℃、时间5.5 d 及pH 6.0。通过淡紫紫孢菌M7a 固体发酵平行3 次试验来验证该最佳条件，结果所得壳聚糖酶活力分别为16.69，16.96，16.76 U/mL，平均值为16.80 U/mL，回归模型预测值为16.90 U/mL，相对误差为0.59%。实际测量值与模型预测值拟合较好，因此利用响应面法优化淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶活力具有可行性。与采用液体发酵产壳聚糖酶的Bacillus thuringiensis ZJOU-010（4.16 U/mL）[30]、Bacillus cereus D-11（4.84 U/mL）[31]以及Penicillium sp.IB-37-2（3.0 U/mL）[12]相比，淡紫紫孢菌M7a 固体发酵产壳聚糖酶活力更高且具有优势。

2.4 淡紫紫孢菌M7a 产壳聚糖酶的SDSPAGE 及酶谱分析

菌株M7a 在最佳固体发酵条件下培养，其壳聚糖酶粗酶液的SDS-PAGE 及酶谱见图5。在胶体壳聚糖的诱导下，酶谱中有1 条明显的暗带，表明该菌株所产的一种壳聚糖酶，对照marker 及SDS-PAGE 电泳图，对应的蛋白质分子质量为40 ku。目前报道的壳聚糖酶分子质量大多为20～75 ku[1]，其中真菌壳聚糖酶分子质量一般大于40 ku[22]，Penicillium sp.IB-37-2 被发现产生分子质量分别为89，41 ku 的两种优势蛋白[13]。Paecilomyces lilacinus 壳聚糖酶分子质量为23 ku[32]和95 ku[20]分别于2005 年和2013 年被发现，尚没有关于淡紫紫孢菌40 ku 壳聚糖酶的报道。

注：Std：170 Marker；1 道为固体发酵粗酶液；2 道为酶谱。图5 淡紫紫孢菌M7a 的粗酶液电泳图及壳聚糖酶酶谱Fig.5 SDS-PAGE and chitosanase zymogram analysis of the crude proteins from P.lilacinum M7a

3 结论

本试验从中国杭州土样中分离纯化出一株传代稳定且产壳聚糖酶活力较高的菌株M7a，鉴定为淡紫紫孢菌（P.lilacinum）。采用单因素和响应面优化试验，获得其最佳固体发酵产壳聚糖酶条件：10 g/L 胶体壳聚糖+5 g/L 葡萄糖、10 g/L 蛋白胨、培养基初始pH 值为6.0、豆粕麸皮质量比7∶5、发酵温度33 ℃、发酵时间5.5 d。通过回归模型方差分析得出，发酵时间对产酶影响极显著（P＜0.01），发酵温度和温度时间交互作用对产酶的影响显著（0.01＜P＜0.05）。综上，淡紫紫孢菌（P.lilacinum）M7a 固体发酵产壳聚糖酶水平达到16.80 U/mL，是初始液体发酵的5.1 倍。本试验深入探究淡紫紫孢菌M7a 的产壳聚糖酶固体发酵条件，极大提高了其产酶能力，为其未来在食品工业等方面的广泛应用提供数据基础。