李柯,郑素娇,王晓莉,孙哲,叶文武,王源超,郑小波

(南京农业大学植物保护学院,江苏 南京 210095)

根腐病是大豆生产中危害最重的病害之一,在全球各大豆主产区均有发生。近年来,该病在我国东北和黄淮海等大豆主产区发生严重,一般可造成大豆减产10%～30%,重病地区可减产60%以上,甚至导致绝收[1]。大豆根腐病为土传病害,大豆根部和茎基部发病后,影响植株地上部分水分和营养供给,生长受阻,严重时造成植株枯死[2]。根腐病是大豆田缺苗断垄和植株早衰的重要原因之一。

引起大豆根腐病的病原菌有多种,常见的有大豆疫霉(Phytophthorasojae)、腐霉(Pythiumspp.)、镰孢菌(Fusariumspp.)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)等。在我国东北和黄淮海等大豆主产区,危害最大的主要是大豆疫霉和镰孢菌,镰孢菌的主要种类有茄腐镰孢菌(Fusariumsolani)、黄色镰孢菌(F.culmorum)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、木贼镰孢菌(F.equseti)、尖孢镰孢菌(F.oxysporum)和层出镰孢菌(F.proliferatum)等[3-6]。有报道指出,我国黄淮海地区的大豆根腐病常由多种病原菌复合侵染引起,大豆疫霉和镰孢菌的复合侵染可加重根腐病的发生与危害[7]。

由于大豆根腐病主要为害大豆植株地下部,防控较为困难。使用抗病品种是防控该病最为经济有效的方法。过去的抗病品种筛选大多只针对某一种或某一类病原菌,如:大豆疫霉根腐病菌[8-9]或大豆镰孢根腐病菌[10-11],而对于是否同时抗多种(类)根腐病菌,则关注较少。

本研究以国家大豆良种攻关项目2019—2020年选育的251份大豆品种(系)为材料,鉴定了这些品种(系)对大豆疫霉和多种镰孢菌的抗性水平,筛选出可以同时抗大豆疫霉多种致病型和多种镰孢菌的抗性品种(系),以期为利用抗病品种防控大豆根腐病及后续抗病育种提供有力支撑。

1 材料与方法

1.1 供试大豆种质资源

供试的251个大豆材料为2019—2020年国家大豆良种攻关项目新选育的品种(系),由中国农业科学院作物科学研究所孙石老师提供。以‘合丰47’为感病对照品种,由黑龙江省农业科学院佳木斯分院植物保护研究所丁俊杰老师提供。

1.2 供试大豆疫霉菌株

供试的8个不同致病型大豆疫霉菌株(Ps1、Ps3、Ps4、Ps5、USAR2、Ps41-1、PsMC1和PsJS2)由南京农业大学卵菌与真菌分子生物学实验室和中国农业科学院作物科学研究所朱振东教授团队分离、收集并保存共享。各菌株在大豆鉴别寄主上的致病表型见杨瑾等[9]的报道。菌株在25 ℃黑暗条件下采用10% V8培养基[12]培养7～10 d用于接种。

1.3 供试镰孢菌菌株

选取6个引起大豆镰孢根腐病的常见种,每种镰孢菌各选取1株致病力较强的菌株作为供试菌株,分别是茄腐镰孢菌Fs-1、黄色镰孢菌Fc-4、禾谷镰孢菌Fg-1、木贼镰孢菌Fe-9、尖孢镰孢菌Fo-2和层出镰孢菌Fp-2。上述菌株由南京农业大学卵菌与真菌分子生物学实验室分离保存并测定致病力(表1),在25 ℃黑暗条件下采用PDA培养基培养5～7 d用于接种。

表1 供试的镰孢菌菌株及其致病力

1.4 抗性鉴定方法

1.4.1 大豆疫霉根腐病的抗性鉴定方法和分级标准病原菌接种及抗性分级标准参照杨瑾等[9]的方法。用直径1.5 cm的打孔器打取菌饼,在接种部位用无菌手术刀划微小伤口,菌丝面朝下贴在伤口处,用灭菌水润湿的吸水纸包裹下胚轴保湿。每个接种处理设5个重复,再用锡箔纸包裹。置于25 ℃、10 h光照和14 h黑暗条件下,5 d后记录发病结果。以空白V8培养基替代菌饼作为对照。

抗性分级标准:高抗(R)为接种部位无发病症状或轻微变褐,植株长势与对照相似;中抗(I)为接种部位表皮明显变褐,但病斑未上下扩展且未绕茎,茎内部组织未受侵染;感病(S)为接种部位茎组织明显坏死,病斑绕茎且向上下扩展,植株比对照矮小,根系不能正常生长。

1.4.2 大豆镰孢根腐病的抗性鉴定方法和分级标准大豆对镰孢菌的抗性鉴定方法和分级标准参照姚艳[11]的方法。每个接种处理设5个重复,接种5 d后记录发病结果。以空白PDA培养基替代菌饼作为对照。

抗性分级标准:高抗(R)为接种部位基本无发病症状,植株长势与对照相似;中抗(I)为接种部位表皮变褐,病斑未上下扩展且未绕茎侵染,植株长势与对照相似;感病(S)为接种部位变褐腐烂,病斑从接种部位沿茎上下扩展且绕茎侵染,植株矮小,根系不能正常生长。

1.4.3 大豆品种(系)对大豆疫霉和镰孢菌综合抗性的分析方法本研究以供试菌株对各供试品种(系)的毒力频率[13],作为评价品种(系)的综合抗性指标。毒力频率=致病表现为感病的菌株数/供试菌株总数×100%,如计算得出的毒力频率低,则品种(系)的综合抗性水平高。品种抗性反应型的统计参照Kyle等[14]的方法,将中抗(I)和高抗(R)均计为抗性类型。

2 结果与分析

2.1 供试大豆品种(系)对大豆疫霉8个不同致病型菌株的抗性鉴定

251个大豆品种(系)对大豆疫霉8个不同致病型菌株的反应型见表2。本研究共筛选到19个对8个大豆疫霉菌株均表现高抗的大豆品种(系),占供试大豆总数的7.6%;69个品种(系)能够抗7个大豆疫霉菌株,占27.5%;49个品种(系)能够抗6个大豆疫霉菌株,占19.5%;30个品种(系)能够抗5个大豆疫霉菌株,占12.0%。能够抗5个及5个以上菌株的抗病品种(系)数量达167个,占供试大豆总数的66.5%。

表2 供试大豆品种(系)对8个大豆疫霉菌株的反应型

续表2 Table 2 continued

续表2 Table 2 continued

对于8个不同致病型的大豆疫霉菌株,大豆抗病品种(系)的比例存在较大差异(图1)。其中对菌株Ps1、Ps3、Ps5和PsMC1的抗性资源最丰富,其次是Ps4和USAR2,而对Ps41-1和PsJS2的抗性资源较少。

图1 供试大豆品种(系)对8个大豆疫霉菌株的抗性鉴定结果

2.2 高抗大豆疫霉的大豆品种(系)对6种镰孢菌的抗性鉴定

在上述鉴定结果的基础上,选择21个高抗大豆疫霉的大豆品种(系)(其中16个可同时抗大豆疫霉8个菌株,其余5个分别抗7个和6个菌株),进一步测定这些品种(系)对茄腐镰孢菌Fs-1、黄色镰孢菌Fc-4、禾谷镰孢菌Fg-1、木贼镰孢菌Fe-9、尖孢镰孢菌Fo-2和层出镰孢菌Fp-2(强毒力菌株)的抗性,以期筛选出既抗大豆疫霉又抗镰孢菌的品种(系)。

从表3可见:不同大豆品种(系)对6种镰孢菌的抗性存在较大差异。其中,可同时抗4种镰孢菌(含中抗和高抗)的品种(系)有4个,而抗3种、2种和1种镰孢菌的品种(系)分别有6、10和1个;不同品种(系)对6种镰孢菌的抗性谱具有差异,如:‘郑1905’‘徐1726’‘皖宿218’和‘徐1017-1’均可高抗或中抗4种镰孢菌,但前两者可同时抗Fs-1、Fc-4、Fg-1和Fo-2,而后两者则同时抗Fs-1、Fc-4、Fg-1和Fe-9。

表3 供试大豆品种(系)对6种镰孢菌的反应型

比较对不同镰孢菌表现抗性的品种(系)比例(图2),结果显示供试大豆品种(系)对Fs-1、Fc-4和Fg-1的抗性资源较丰富,对Fe-9和Fo-2的抗性资源较少,而对Fp-2均高度感病。

图2 供试大豆品种(系)对6种镰孢菌的抗性鉴定结果

2.3 双抗大豆疫霉和镰孢菌的大豆品种(系)筛选结果

根据8个大豆疫霉菌株和6个镰孢菌菌株对每个供试大豆品种(系)的毒力频率(表4),比较21个品种(系)之间的综合抗性水平。结果表明,两类病原菌对‘郑1905’‘徐1726’‘皖宿218’和‘徐1017-1’这4个品种(系)的毒力频率最低(14.3%),即上述4个品种(系)对大豆疫霉根腐病和大豆镰孢根腐病具有较好的综合抗性;其次是‘沧豆1434’‘安豆1215’‘商豆2005’和‘阜豆169’,毒力频率均为21.4%;此外,有8、3和2个大豆品种(系)的毒力频率分别为28.6%、35.7%和42.9%,而‘合丰47’(感病对照)的毒力频率最高,达到71.4%。

表4 供试大豆疫霉和镰孢菌菌株对不同大豆品种(系)的毒力频率

3 讨论

长期以来,大豆种质对根腐病的抗性鉴定备受关注。杨瑾等[9]利用农业农村部公益性行业(农业)科研专项“作物疫病监测防控技术研究与示范”项目组推荐的8个不同致病型的大豆疫霉菌株,以及改进后的黄化苗下胚轴接种法,对2017—2018年在黄淮海地区收集的439个大豆品种(系)进行抗性鉴定,结果发现43个品种(系)能够高抗超强毒力菌株PsJS2,其中‘皖豆21020’‘徐9302-A’‘科豆10’‘立地055’对所有的8个菌株具有抗性。姚艳[11]对2015年来自黄淮地区(安徽、江苏和山东)的80个大豆品种(系)进行大豆镰孢根腐病抗性评价,发现对茄腐镰孢菌、木贼镰孢菌、禾谷镰孢菌、层出镰孢菌和尖孢镰孢菌的抗性比例分别是82.9%、61.3%、31.3%、4.2%和6.3%。除了对单种(类)根腐病菌的抗性种质鉴定,顾鑫等[15]于2009年从220个大豆种质中筛选到3个同时抗尖孢镰孢菌、腐霉菌和大豆疫霉的种质(‘抗线 2号’‘邓恩’和‘大粒黄’)。本研究基于我国2019—2020年新选育的251个大豆品种(系),选用8个具有不同致病型的大豆疫霉菌株和6种镰孢菌菌株进行抗性评价,发现抗大豆疫霉5个及5个以上致病型菌株的品种(系)比例达66.5%,并在21个高抗大豆疫霉的品种(系)中,发现抗3种及3种以上常见镰孢菌的品种(系)比例达47.6%,表明我国新育大豆品种(系)中对不同根腐病菌的多抗资源较为丰富,研究结果可为大豆多抗根腐病菌种质资源的筛选及复合侵染的抗性机制研究提供了新的资源与数据。

研究结果中,有部分品种(系)对供试大豆疫霉和镰孢菌表现为中等抗性(I)。供试品种(系)仅在下胚轴接种部位表皮出现褐色病变,但病斑仅局限在接种部位而未向上下扩展,也未环绕茎部,且茎内部组织基本未发病。上述表型应属典型的抗病反应类型,但抗性程度低于高抗类型,故被计为中抗类型。该类品种(系)的黄化苗经接种后,在人工创造的最适宜病原菌侵染的温湿度条件下仍可较好生长,植株长势与未接种的对照相似,提示此类品种(系)对防控大豆根腐病仍具良好的应用价值。本研究选用的镰孢菌菌株分离自黄淮海地区采集的大豆根腐病组织,并通过对3个大豆品种的致病力测定进行筛选。除茄腐镰孢菌Fs-1菌株为中等致病力外,其余5种镰孢菌菌株均表现强致病力,提高了抗性鉴定结果的可靠性。后续研究可进一步筛选、扩大每种镰孢菌的供试菌株数量,有利于更全面反映供试品种(系)对镰孢菌的抗性。供试的21个大豆品种(系)对Fs-1的抗性比例高,可能与该菌株致病力相对偏弱有关。此外,在供试品种(系)中未筛选到对层出镰孢菌Fp-2的抗性种质,表明我国大豆对层出镰孢菌的抗性资源可能并不丰富;该结果与姚艳[11]和杨帅[16]等报道的结果相似,提示应加强关注对该种镰孢菌的抗性种质资源挖掘及抗性研究。