颜 伟 王雅琦 李江龙 陈潭琇

卵巢癌属于恶性肿瘤之一，在妇科肿瘤中致死率名列第1位，5年生存率<25%，由于早期缺乏特异性临床表现，患者经诊断大部分处于晚期或者已发生转移[1-2]。目前，对于卵巢癌患者，术后辅以化疗是国内外公认的标准治疗方法，影响化疗敏感性基因已受学者们的广泛关注。传统的系统性放疗在临床上也有一定的价值，然而探讨影响放疗敏感性基因的研究较少[1,3]。因此，寻找导致放疗耐受的基因并探索其分子机制显得尤为迫切。泛素化特异性蛋白酶39(USP39)是去泛素化家族成员之一，多项研究显示USP39在多种类型的肿瘤组织中表达异常升高，并且可促进肿瘤的发生发展。另外，有报道显示USP39敲降后可逆转化疗耐受。本研究拟对卵巢癌细胞ES2进行USP39敲降后再进行X线照射，通过检测凋亡水平及凋亡和DNA损伤相关蛋白表达情况，探讨USP39的表达水平对卵巢癌细胞放疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

山羊抗兔/小鼠的单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；蛋白定量试剂盒及化学发光液购自美国Thermofisher公司；USP39单克隆抗体购自美国Abcam公司，Caspase3和PARP单克隆抗体购自Cell Signaling公司，β-actin单克隆抗体购自Sigma公司；转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；ES2及HEK293T细胞购自ATCC细胞库。

1.2 方法

1.2.1 USP39-shRNA的合成 USP39-shRNA序列及对照序列shGFP均由上海生物工程股份有限公司合成，分别命名为shUSP39#1、shUSP39#2、shGFP。

1.2.2 细胞培养与转染 用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养HEK293T细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养ES2细胞，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。待HEK293T细胞达到70%～80%满后，将合成的shGFP、shUSP39#1和shUSP39#2按照脂质体试剂说明操作经Lipofectamine2000转入细胞中，48 h后，收集培养上清病毒液，800 g离心10 min，用0.45 μm滤器过滤，-80 ℃保存。将过滤后的病毒上清以1∶3的体积比加入ES2细胞培养上清中，另外加入5 mg/ml的polybrene，转染后细胞分别命名为shGFP组、shUSP39#1组、shGFP#2组。

1.2.3 Western Blot 收集经或者不经6 Gy X线照射10 min的ES2 shGFP、ES2 shUSP39#1和ES2 shGFP#2细胞，用细胞裂解液 (1% Triton X-100；10 mM Tris-HCl，pH 7.4；150 mM NaCl；0.25% 去氧胆酸钠；5 mM EDTA，pH 7.4) 于冰上裂解20～30 min后，12 000 rpm离心15 min，收集蛋白上清，用BCA试剂盒测蛋白浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4 ℃一抗孵育过夜，室温二抗孵育1 h，最后曝光成像。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件分析，计量资料采用t检验。若P<0.05，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 USP39敲降后对ES2细胞凋亡的影响

本研究利用APC标记的Annexin V和PI双染法结合流式细胞术检测了USP39敲降对ES2细胞凋亡的影响，结果显示：与阴性对照组相比，USP39 敲降组细胞凋亡明显增加，细胞经6 Gy X线照射后，细胞凋亡明显增加，且USP39 敲降组更为明显，结果具有统计学差异(P<0.05，图1)。

图1 USP39敲降诱导ES2细胞凋亡

2.2 USP39敲降后对ES2细胞凋亡相关蛋白及DNA损伤修复相关蛋白的影响

Western Blot结果显示，shUSP39#1和shUSP39#2均有效抑制了ES2细胞USP39的表达。shGFP对照组细胞shUSP39干扰ES2细胞均不接受或者接受6 Gy X线照射，结果显示，与未经X线照射组比较，shUSP39干扰组在经X线照射后凋亡相关蛋白cleaved-PARP和cleaved-Caspase3表达水平明显升高(P<0.05)，DNA损伤相关蛋白γ-H2A.X表达明显升高，且shUSP39#1组的效果优于shUS39P#2(P<0.05)。见图2。

图2 USP39敲降调控细胞凋亡及DNA损伤相关蛋白

3 讨论

随着中国社会的老龄化发展，卵巢癌的发病率呈逐年上升的趋势，且发病趋于年轻化。卵巢癌早期无明显临床症状，70%在发现时处于晚期，晚期卵巢癌的生存率低于30%[4]。放疗是用于极晚期、局部复发性或难治性卵巢癌的姑息性或局部性治疗的手段之一，大多数卵巢对放疗具有放射抗拒性[5]。有研究表明诱导肿瘤细胞发生凋亡或DNA损伤是肿瘤放射治疗的主要机制之一，影响肿瘤放疗敏感性的因素诸多，其中某些基因的异常表达被认为影响肿瘤放射敏感性，目前国外研究较多，但尚未定论[6]。郑琳报道RbAp48的表达水平影响宫颈癌细胞的放射敏感性，对RbAp48进行敲降，SiHa、Caski和HeLa细胞的凋亡比例明显高于对照组，其中以SiHa细胞最为明显[7]。

本研究利用慢病毒介导的USP39基因沉默，结果显示USP39表达下调促进ES2细胞凋亡，ES2细胞经6Gy照射后，与未经照射组相比，USP39敲降组凋亡相关蛋白cleaved-PARP和cleaved-Caspase3表达水平明显高于对照组，DNA损伤相关蛋白γ-H2A.X表达水平升高，提示ES2细胞经USP39敲降后放射敏感性提高，证实USP39与放射敏感性有关。USP39基因可能在放疗过程中，启动诸多相关功能通路，从而发挥改变放疗敏感性的作用。

综上所述，USP39的表达可能与卵巢癌放射敏感性相关，USP39基因沉默能增强卵巢癌细胞的放射敏感性，这将为探寻卵巢癌放射抗拒性的机制提供新的理论依据。USP39表达水平可能对于预测卵巢癌放疗敏感性有所帮助，有望成为卵巢癌治疗的新靶点，对防治卵巢癌，延长患者生命，提高患者生存质量等具有极为重要的意义。