刘佳瑞，孙 斌，崔晓宾，徐 江

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是头颈部恶性肿瘤中最常见的肿瘤之一[1]。近年来对OSCC早期诊断生物标志物以及治疗靶点等方面研究虽然有新的进展[2]，但目前OSCC患者总体存活率仍然较低[3]。因此，为提高OSCC患者的存活率，寻找OSCC的新型生物标志物和治疗靶点至关重要。磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon-1, PLCE1)由染色体10q23上的PLCE1基因编码，属于磷酸肌醇特异性磷脂酶C(PLC)家族[4]。最近的研究报道显示，PLCE1可能在多数肿瘤的发生、进展中发挥重要作用，包括食管癌、胃癌、膀胱癌和结直肠癌等[5-8]。但是，有关PLCE1在OSCC中表达的研究较少。本实验采用免疫组化EnVision法检测PLCE1在OSCC和癌旁正常组织中的表达，并探讨PLCE1表达与OSCC临床病理特征和术后生存率的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2004～2018年石河子大学医学院第一附属医院病理科存档的石蜡包埋OSCC标本合计124例，同时选取对应的癌旁正常组织(距离癌组织2 cm以上)63例作为对照组，并收集患者完整的临床病理资料。其中男性71例，女性53例，平均年龄67岁(34～84岁)，患者术前均未接受过放疗或化疗。所有病例的TNM分期是以口腔癌TNM分期(UICC 2010)为依据划分。通过电话、医院病历或其他方法对124例患者进行随访，随访截止日期为2019年5月31日。参与本实验的所有患者均签署书面知情同意书。

1.2 组织芯片的制备核对所选取的OSCC蜡块组织的HE切片病理诊断，并在玻片上对该区域进行标记，对照HE切片上相应的区域在蜡块上准确的标记组织芯片取材位点，使用Mitogen公司MiniCore组织芯片制作仪构建组织芯片，4 μm厚连续切片备用。

1.3 方法免疫组化染色采用EnVision两步法。PLCE1兔多抗购自美国Affinity公司，稀释度1 ∶1 200。所有染色结果均由两位高年资的病理医师独立双盲法阅片，PLCE1定位于细胞质中，以呈棕黄色颗粒为阳性。(1)按细胞着色强度计分：无着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕色为3分。(2)按阳性细胞的百分比计分：<5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分，将两项得分结果相乘：9～12分为()，5～8分为()，2～4分为(+)，0～1分为(-)。其中≤8分为低表达，>8分为高表达。若对结果存在分歧则请第三位医师阅片。

1.4 统计学分析所有数据使用SPSS 21.0软件进行统计学分析。用χ2检验评估PLCE1表达与其他变量间的相关性。ROC曲线和曲线下面积(AUC)用于评估PLCE1表达对于预测OSCC的特异度和灵敏度。使用Kaplan-Meier法进行生存分析，并使用对数秩检验分析存活曲线。使用Cox比例风险模型计算该不同变量的单变量和多变量风险比。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OSCC中PLCE1蛋白的表达及与临床病理特征的关系PLCE1在OSCC组织中主要定位于细胞质，OSCC中PLCE1的表达水平明显高于癌旁正常组织。PLCE1在OSCC组织中多呈高表达，在正常组织中不表达或低表达(图1)。PLCE1在OSCC及正常组织中的高表达率分别为41.9%(52/124)和0(0/63)，差异有统计学意义(P<0.000 1，表1)。PLCE1表达与OSCC患者年龄、性别、肿瘤分化程度、T分期、淋巴结转移及临床分期无关(P>0.05，表2)。

图1 A.PLCE1在OSCC中高表达，EnVision两步法；B.PLCE1在癌旁正常组织中低表达，EnVision两步法

表1 OSCC及癌旁正常组织中PLCE1的表达

表2 OSCC中PLCE1蛋白表达与临床病理特征的关系

2.2 PLCE1表达与OSCC的ROC曲线分析本实验使用ROC曲线分析PLCE1在OSCC及对照组织中免疫组化评分的诊断价值。结果显示PLCE1表达在OSCC的ROC曲线下AUC值为0.954(95%CI：0.925～0.982)(图2)，使用诊断临界值确定OSCC的灵敏度和特异性，同时最小化假阴性率和假阳性率，得出OSCC的灵敏度和特异性分别为83.9%和95.2%(诊断临界点为7)。

图2 ROC曲线分析PLCE1在OSCC及对照组织中免疫组化评分

2.3 PLCE1蛋白表达与OSCC患者预后的关系124例OSCC中，74例患者获得临床随访信息。随访截止日期为2019年5月31日或死亡日期。对74例OSCC患者的单因素分析显示，PLCE1蛋白高表达患者比低表达患者预后较差。Kaplan-Meier分析结果显示，PLCE1蛋白高表达患者的生存时间与PLCE1蛋白低表达患者相比差异有显著性(χ2=8.416，P=0.004，图3A)，PLCE1高表达患者的术后病死率高于低表达患者。此外，T分期对OSCC患者的预后也具有显著的意义(χ2=9.647，P=0.002，图3B)。

图3 PLCE1蛋白表达与OSCC患者预后生存分析：A.PLCE1表达；B.T分期

2.4 OSCC患者的Cox单因素及多因素分析对PLCE1蛋白表达和所有临床病理学因素进行单因素Cox回归分析，结果显示，PLCE1过表达(P=0.006；风险比为3.117，表3)和T分期(P=0.004；HR为3.330)是单因素Cox回归模型中的重要因素；多因素分析显示，PLCE1过表达(P=0.008；HR为3.027)和T分期(P=0.005；HR为0.312)与死亡有关，是OSCC患者独立的预后因素。

表3 Cox单因素及多因素分析影响OSCC患者生存的临床病理因素

3 讨论

PLCE1与PLC家族的其他分子相比具有不同的功能，其是调节细胞生长、分化、凋亡和血管生成的Ras家族蛋白的重要效应物[9]。最近的研究表明PLCE1的异常表达与肿瘤的发生和发展有关。Yue等[10]的研究表明，PLCE1在非小细胞肺癌组织和细胞系中高表达，可通过促进PTEN甲基化抑制非小细胞肺癌的细胞凋亡；而在Wang等[11]的研究中发现，PLCE1可作为结肠癌的抑癌基因，抑制肿瘤细胞的增殖。然而，关于PLCE1的表达及其在OSCC中的研究很少。

在本组实验中，作者发现OSCC组织中PLCE1蛋白表达较癌旁正常组织明显增高，提示PLCE1蛋白可能是潜在的有价值的生物标志物。目前国内外有关PLCE1表达与OSCC患者临床病理资料相关研究极少。仅有李晓岑等[12]对83例OSCC患者进行免疫组化分析的报道，结果显示PLCE1蛋白在OSCC中的高表达率为53.0%，且PLCE1蛋白与肿瘤分化程度、T分期、临床分期、N分期密切相关。这与本组结果存在差异，究其原因可能与样本量的选择区域等因素有关，后期我们需要加大样本量来进一步分析。AUC被认为是评估一个试验诊断价值最好的指标，本实验通过ROC曲线分析，表明PLCE1有较高诊断效能，提示PLCE1对OSCC的诊断具有较高的灵敏度(83.9%)和特异性(95.2%)。并应用ROC曲线确定了诊断OSCC的临界值，为今后诊断OSCC提供一种新的生物学检测方法。总之，这些结果支持PLCE1可能是OSCC潜在的一种新型临床诊断和预后的生物标志物。

研究表明PLCE1在其他恶性肿瘤中具有预后意义。Cheng等[13]报道，PLCE1低表达与肝细胞癌的进展相关，并且可能作为其预后的生物标志物；此外，张晓娟等[14]报道了PLCE1在食管鳞状细胞癌中呈高表达，且与临床分期、淋巴结转移及肿瘤最大径密切相关，提示PLCE1可能与食管鳞状细胞癌的不良预后相关。PLCE1似乎通过调节PKCα激活NF-κB信号通路，促进食管癌细胞的侵袭和迁移，这可能成为治疗食管癌的新靶点[15]。在本实验中，作者对纳入的患者进行跟踪随访，应用Kaplan-Meier法对两组患者的生存率进行比较分析，结果发现PLCE1高表达组患者的术后生存时间明显低于低表达组，证实了PLCE1与OSCC患者的生存率密切相关，可应用PLCE1来判断OSCC患者预后。在本实验中也对OSCC患者不同的临床病理特征进行了生存分析，结果表明T分期对患者的预后有重要的意义，而年龄、性别、分化程度、淋巴结转移和临床分期各组间无明显差异。单因素Cox回归模型分析结果与上述结果一致。此外，多因素Cox比例风险回归模型结果显示，PLCE1高表达和T分期具有较高的风险比，分别为3.027和3.205，说明两者均是影响OSCC患者能否长期存活的独立预后指标。总之，以上结果表明PLCE1表达与OSCC患者的术后生存时间密切相关，具有重要的预后意义，PLCE1表达越高，患者预后越差。

综上所述，本组实验发现，PLCE1在OSCC中高表达，PLCE1高表达是OSCC预后不良的重要独立预后因素，因此可用作OSCC患者诊断和预后评估的潜在生物标志物。但是我们还需要大量的临床样本结合临床资料随访来明确PLCE1表达与OSCC各种临床病理特征的相关性，PLCE1及其下游相关信号分子在OSCC中的表达情况的研究也将成为下一阶段的研究方向。